《Analytica Chimica Acta》：A developed cascade DNA recycling amplification integrating with microchip electrophoresis for ultrasensitive detection of
Cronobacter sakazakii
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本研究开发了一种基于APE1酶促切割和Klenow聚合酶催化的递归等温核酸扩增（AATRA-SGSDA）结合微芯片电泳（MCE）的检测策略。通过设计闭环发夹探针（cHP），利用两步结构转换机制实现高效特异性扩增，检测限达3 CFU/mL，线性范围101-10? CFU/mL，并成功应用于奶粉样本中的 Cronobacter sakazakii 快速检测。
双唐|刑庚|练建安|韩梦梦|李思进|张帆|王青江
华东师范大学化学与分子工程学院，中国上海东川路500号，200241
摘要
级联等温核酸扩增技术（cascade INAATs）比单一INAATs更具敏感性，并在近年来被应用于生物分析领域。本文首次研究了一种基于脱嘌呤/脱嘧啶内切酶1（APE1）辅助的目标回收扩增（AATRA）和结构门控链置换扩增（SGSDA）的级联DNA回收扩增策略。其主要改进在于设计了一种特殊的封闭锁式发夹探针（cHP），该探针构建了一个具有独特“两步构象切换”机制的级联扩增系统。首先，在AATRA过程中，cHP通过APE1的切割作用转化为可转化的发夹探针（tHP）；其次，tHP在Klenow片段（KF）聚合酶的催化下发生关键结构转变，生成自启动模板，从而启动SDA过程。这种新型SDA可称为SGSDA。严格的酶触发“两步构象切换”机制是整个级联扩增过程的关键驱动因素和控制点，显著提高了扩增特异性，并降低了交叉反应和背景信号。将这种级联回收扩增技术与微芯片电泳（MCE）结合，用于定量检测C. sakazakii菌。在最佳条件下，AATRA-SGSDA-MCE生物传感方法实现了10^1至10^6 CFU/mL的宽线性检测范围，C. sakazakii的检测限为3 CFU/mL。此外，该策略还成功应用于人工污染奶粉中C. sakazakii的检测，展示了其快速检测、高灵敏度和强特异性的优势。
引言
Cronobacter sakazakii是一种革兰氏阴性细菌，属于Cronobacter属中最毒的物种[1],[2]。作为一种食源性病原体，它已被从婴儿配方奶粉（PIF）中分离出来，可能导致新生儿和婴儿出现威胁生命的病症，包括脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和呼吸道感染[3],[4]。此外，免疫系统受损的成年人，尤其是老年人，也可能易受C. sakazakii感染[5]。
目前，传统的细菌培养方法仍被广泛用于细菌检测[6],[7]。该方法依赖于观察细菌在固体培养基上的生长来进行鉴定和计数，但耗时较长（2-3天），且灵敏度较低[8],[9]。因此，开发高灵敏度和选择性的C. sakazakii检测方法具有重要意义。基于适配体的定量细菌检测方法作为一种分子生物学技术，具有分析速度快、灵敏度高和特异性强的优势[10],[11]。据报道，基于适配体特异性识别和捕获能力的检测方法也已应用于C. sakazakii的检测[12],[13]。
核酸扩增技术已被应用于多种分析任务，如传染病诊断、基因克隆和病毒载量监测[14],[15]。聚合酶链反应（PCR）作为黄金标准检测方法，是最常用的扩增技术之一[16],[17]。它也被用于检测C. sakazakii的特征基因[18]。然而，PCR需要能够精确控制温度的专用设备，并且容易产生假阳性信号[19],[20]。相比之下，等温核酸扩增技术（INAATs）仅需恒温设备，操作流程简单，适用于更广泛的操作环境[21],[22]。近年来，INAATs不断得到发展并得到广泛应用，包括指数扩增反应（EXPAR）[23]、链置换扩增（SDA）[24]、目标回收扩增（TRA）[25]、滚环扩增（RCA）[26]、催化发夹组装（CHA）[27]和杂交链反应（HCR）[28]等。
为了提高等温扩增检测的灵敏度，级联INAATs技术得到了进一步发展并得到应用[29],[30]。Pang等人开发了一种利用级联SDA检测大肠杆菌的荧光生物传感器[31]；Dong等人提出了一种结合级联SDA和空间位阻控制DNA步行器的策略来检测microRNA-21[32]；Fu等人设计了双自启动发夹探针介导的SDA来检测循环肿瘤DNA[33]。然而，这些级联SDA策略容易发生交叉反应和背景信号增强，这可能是由于反应系统中DNA序列丰富或SDA模板结构设计缺陷所致。
等温核酸扩增后，反应体系通常包含目标扩增产物以外的多种DNA片段[34]。为了区分扩增产物和其他DNA序列，常采用微芯片电泳（MCE）进行快速分离。这种现代MCE技术高度自动化，无需制备凝胶，从样品应用到数据分析的所有步骤均可自动完成[35],[36]。MCE的分析灵敏度受其检测过程中样品消耗量的限制；然而，将MCE与等温核酸扩增技术结合的检测方法已很大程度上解决了这一问题[37]。这类检测方法广泛应用于各种生物样本的分析，包括细菌[38]、细胞[39]、蛋白质[40]和外泌体[41]。
本研究首次提出了一种基于脱嘌呤/脱嘧啶内切酶1（APE1）辅助的目标回收扩增（AATRA）和结构门控链置换扩增（SGSDA）的级联DNA回收扩增策略。其核心在于设计了一种带有脱嘌呤/脱嘧啶（AP）位点的封闭锁式发夹探针（cHP），其独特的构象切换机制是该级联扩增策略的基础。首先，在AATRA过程中，只有当cHP与目标DNA形成双链复合物时，APE1才能切割cHP中的AP位点，生成可转化的发夹探针（tHP）；其次，tHP必须在Klenow片段（KF）聚合酶的催化下发生关键结构转变，形成新的茎环结构，从而在后续扩增过程中作为自启动模板。这种新型SDA可称为SGSDA。在其他利用自启动模板的SDA系统中，模板的碱基序列在整个反应过程中通常保持不变，最终模板结构依赖于模板与目标序列之间的简单结合[42],[43]。这意味着在没有目标序列的情况下，模板很可能自行形成另一种结构，导致高背景信号。我们设计的模板避免了这一问题。在这种结构门控SDA中，自启动模板的生成需要原始探针cHP经历两个步骤：APE1介导的解锁过程和KF聚合酶介导的构象变化。这种更严格的酶触发“两步构象切换”机制显著提高了扩增特异性，并大幅降低了级联回收扩增过程中的交叉反应和背景信号。
为了验证这种级联DNA回收扩增方法的适用性，将其与MCE结合，用于检测C. sakazakii。适配体修饰的磁珠捕获C. sakazakii并释放主DNA（mDNA），经过磁分离后，mDNA作为目标DNA与cHP结合，触发级联DNA回收扩增过程。通过仔细设计cHP的结构和优化AP位点的位置，AATRA-SGSDA-MCE生物传感策略实现了10^1至10^6 CFU/mL的线性检测范围和3 CFU/mL的检测限。此外，该生物传感策略还成功应用于检测受污染奶粉中的C. sakazakii。
试剂和设备
本研究中使用的所有寡核苷酸均由Sangon Biotechnology Co. Ltd.（中国上海）合成并通过HPLC纯化。序列列于表1中。APE1、KF（3?-5?）和Nt. BbvCI购自New England Biolabs（中国北京）。10 × NEBuffer? 2（1 × NEBuffer? 2：50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl?、1 mM DTT；pH 7.9，25°C）也来自New England Biolabs。链霉亲和素磁珠（0.5 μm）、dNTP 10 mM混合物和TE缓冲液（10 mmol/L）亦来自New England Biolabs。
提出的级联DNA回收扩增原理
C. sakazakii被用作本实验的目标分析物，其级联DNA回收扩增机制如图1所示，包括APE1辅助的目标回收扩增（AATRA）和结构门控链置换扩增（SGSDA）。如图1A所示，在级联回收扩增之前，先进行C. sakazakii适配体捕获和磁分离。在目标细菌存在的情况下，带有适配体-mDNA的磁珠与细菌相互作用，适配体捕获C. sakazakii。
结论
本研究开发了一种结合MCE和AATRA-SGSDA策略的方法用于检测C. sakazakii。AATRA过程仅在目标细菌存在时才能被触发，其中封闭锁式发夹探针被APE1切割成可转化的发夹探针。在KF聚合酶的催化下，tHP发生结构变化，从而启动SGSDA过程。cHP的精细结构设计显著降低了背景信号。
CRediT作者贡献声明
李思进：验证、数据整理。
韩梦梦：软件开发、数据整理。
王青江：撰写、审稿与编辑、监督、资源获取、项目管理、方法学设计、资金申请。
张帆：资源协调、概念构思。
双唐：初稿撰写、数据可视化、验证、软件开发、方法学设计、实验实施、数据整理。
练建安：数据可视化、数据整理。
刑庚：数据可视化、验证、数据整理。
数据获取
数据可应作者要求提供。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22074042）的支持。
