《Analytica Chimica Acta》：Development and validation of a UHPLC–MS/MS method for the quantification of total conjugated 3-bromotyrosine and investigation of its association with asthma severity
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本研究开发了高效液相色谱-串联质谱法用于检测尿液中的总共轭溴酪氨酸（TCB），并通过DIVE和PRISMA队列评估其临床意义。结果显示，TCB在哮喘治疗中可能作为非侵入性生物标志物预测氧化应激相关组织损伤及疗效。
Mohamed Gamrani|Asma Farjallah|Floresse Merveilles Kpaossou|Dominic Cliche|Carlos Celis-Preciado|Morgane Gronnier|Simon Couillard|Christiane Auray-Blais
加拿大魁北克省谢布鲁克大学医学院与健康科学学院儿科系医学遗传学部门
摘要
我们开发并验证了一种稳健且灵敏的超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC–MS/MS）方法，用于定量尿液中的总结合溴酪氨酸（TCB）。该方法在验证的浓度范围内表现出优异的线性（R2=0.9995），检测限（LOD）为13.6 pM，定量下限（LLOQ）为45.2 pM。结果通过尿液肌酐进行系统标准化处理，以校正稀释效应。根据监管指南进行的方法验证显示出了良好的选择性、特异性和稳健性。该方法的运行时间为6.51分钟，能够高效进行分析；应用于健康对照样本后，确定了TCB的上限参考值为2.84 pmol/mmol肌酐。该方法被用于评估尿液中TCB在哮喘中的临床意义。在DIVE队列（n = 25；NCT05992519）中，尿液TCB在区分气道高反应性方面的能力有限（AUC = 0.65；95% CI: 0.43–0.88）。然而，在PRISMA队列（n = 26；NCT05870215）中，基线TCB水平较高与口服皮质类固醇治疗第7天后肺功能改善显著相关。多变量建模调整血液嗜酸性粒细胞和呼出氮氧化物分数后显示，尿液TCB仍与功能改善独立相关，而传统炎症生物标志物（血液嗜酸性粒细胞和呼出氮氧化物）的相关性不再显著。尽管这些结果是探索性的且基于次要分析，但TCB可能代表哮喘中氧化应激相关组织损伤和治疗反应的一个无创预测生物标志物。
引言
哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，其特征是气流阻塞可变、支气管高反应性以及症状反复发作。在哮喘的多种表型中，2型（T2）炎症是最常见的类型，由白细胞介素（IL）-4、IL-5和IL-13等细胞因子驱动[1] [2]。这种炎症途径与嗜酸性粒细胞活化密切相关，嗜酸性粒细胞活化在疾病严重程度、发作风险和治疗反应中起核心作用[3] [4] [5]。因此，开发可靠的、无创的生物标志物以反映潜在的气道炎症对于哮喘的临床评估和个性化管理至关重要。
嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）是一种含血红素的酶，在嗜酸性粒细胞活化过程中释放，可催化蛋白质上的酪氨酸残基溴化，生成如3-溴-L-酪氨酸（3-BT）等卤代氨基酸[6] [7] [8] [9]。作为组织重塑的一部分，结合的3-BT被释放并随尿液排出体外。3-BT已被提出作为嗜酸性粒细胞活化和T2炎症的特异性生物标志物。然而，在尿液等生物基质中，3-BT的游离形式通常存在于大多数分析平台的检测限以下。这归因于其快速代谢、高反应性以及大量转化为结合形式（包括4-O-葡糖醛酸-3-溴酪氨酸和酸不稳定结合形式）。实际上，游离尿液中的3-BT含量非常低，占总结合3-BT形式的不到1%，使其直接测量在分析上具有挑战性且往往不可靠。因此，通过酸水解后测量总结合溴酪氨酸（TCB）成为评估嗜酸性粒细胞驱动的炎症、区分重症与非重症哮喘以及预测哮喘发作的更敏感和特异的方法[10] [11]。
与这些观察结果一致，我们实验室最初尝试在患者样本和添加了3-BT的对照样本中测量游离3-BT时未能检测到信号。相比之下，包括Wang等人开发的验证方法[11]在内的先前研究表明，通过酶促或化学水解后测量TCB可以提供更敏感和稳健的嗜酸性粒细胞炎症指标。据报道，尿液中的TCB浓度与哮喘严重程度、疾病控制丧失和发作风险增加相关，突显了该生物标志物在T2型哮喘中的临床意义[12] [13] [14] [15]。
基于这些证据，我们推测结合溴酪氨酸/肌酐生物标志物检测可能是一种无创的尿液检测方法，可用于确认和分层具有2型炎症的哮喘患者。因此，我们旨在开发并验证一种高灵敏度和特异性的超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）方法，用于定量对照组及确诊为2型炎症负担的哮喘患者的尿液中的TCB。
伦理批准
本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行。得到了谢布鲁克大学医学院与健康科学学院机构审查委员会（IRB）的批准（项目编号2024-5373、2023-4791、2023-4687）。最终IRB批准日期为2024年5月15日。
研究人群
共收集了100份参与者的尿液样本
研究参与者的基线特征
表3显示了DIVE和PRISMA队列研究参与者的基线特征，包括人口统计学信息、病史、实验室检测结果、哮喘控制问卷以及全球哮喘治疗指南的相关内容。
UHPLC结果
以正电喷雾离子化（ESI+）模式获得的代表性提取离子色谱图显示了3-BT（表1a）和肌酐（图2）及其各自的同位素标记内标。检测到了3-BT和3-BT-13C6
讨论
本研究开发并完全验证了一种稳健且灵敏的UHPLC–MS/MS方法，用于根据生物分析方法验证的监管要求[32]定量尿液中的TCB。通过尿液肌酐进行标准化处理，以校正尿液浓度的变异性，这是一种在尿液生物标志物分析中广泛采用的方法，可以提高样本间的可比性并支持代谢物浓度的可靠解释[33]
结论
我们开发并验证了一种UHPLC?MS/MS多重方法，用于定量基于肌酐水平标准化的尿液结合溴酪氨酸生物标志物。结果显示出良好的选择性、特异性和稳健性。该方法基于使用酸水解释放结合溴酪氨酸生物标志物，然后通过固相萃取和带有同位素标记内标的靶向质谱检测来实现
CRediT作者贡献声明
Morgane Gronnier：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、研究、数据管理。Carlos Celis-Preciado：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、研究、数据管理。Christiane Auray-Blais：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、监督、资源协调、项目管理、方法设计、研究、资金申请、数据管理、概念构思。Simon Couillard：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、监督、软件支持、资源协调、研究
免责声明
没有任何资助机构参与本研究的设计、数据解释或手稿的编写。
利益冲突
M. Gamrani、F. Kpaossou和Dominic Cliche没有利益冲突。
A. Farjallah因参与本研究获得了报酬。
M. Gronnier从J.A. DeSève基金会获得了为期两年的学生奖学金。
C. Celis-Preciado在当前工作中获得了谢布鲁克大学的教育奖学金。在当前工作之外，他还收到了AstraZeneca、GlaxoSmithKline和Sanofi-Regeneron的演讲酬金以及AstraZeneca的咨询费用。
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Christiane Auray-Blais报告称获得了J.A. DeSève基金会的财务支持。Christiane Auray-Blais与J.A. DeSève基金会的关系包括资金资助。Christiane Auray-Blais没有待审批的专利。A. Farjallah因参与本研究获得了报酬。J.A. DeSève基金会未参与本研究的设计
致谢
我们感谢J.A. DeSève基金会的资助和学生奖学金。感谢Pamela Lavoie的宝贵意见和对手稿的审阅。资助机构未参与患者的选择、数据解释或手稿的编写。我们感谢Waters Corporation在技术和科学方面的支持。
