《Bioorganic Chemistry》：Structure-guided computational design of high-affinity antibodies enables chemiluminescence immunoassay for C-reactive protein
编辑推荐：
结构导向抗体优化策略显著提升CRP检测灵敏度与特异性，通过解析HCAb-CRP复合物晶体结构定位关键拓扑残基，设计CDR突变并经分子动力学模拟验证，最终构建的化学发光免疫分析方法在120例血清样本临床验证中表现出R2>0.98的高相关性及<5%的CV重复性。
李一健|刘同功|王静哲|赵晓娜|文杰|李忠岩|曾福兴|顾大勇
深圳大学第一附属医院医学实验室与分子诊断重点实验室实验室医学系，深圳市第二人民医院，深圳市第二人民医院医学技术创新转化中心，中国深圳518035
摘要
开发出稳健的免疫测定方法依赖于高亲和力的抗体；然而，合理的设 计策略仍然具有挑战性。在这里，我们提出了一个基于结构的计算框架用于抗体优化，并展示了其在临床级化学发光测定中的应用，该测定用于检测C-反应蛋白（CRP）。基于从CRP-HCAb复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构中识别出的关键拓扑残基，我们在互补决定区（CDRs）内合理设计了突变。分子动力学模拟预测优化后的变体具有更好的结合稳定性，这一结果通过基于肽的结合测定得到了进一步验证。经过重组表达后，工程化的抗体——HCAb3-CDR1-MT和HCAb4-CDR2-MT——表现出增强的特异性和亲和力。当这些抗体被配置成夹心化学发光免疫测定时，该系统显示出极佳的精确度（CV < 5%）以及对抗常见血清成分的强抗干扰能力。在一项涉及120个人血清样本的临床验证研究中，该测定方法与商业方法显示出强烈的相关性（R2 > 0.98），并且在区分不一致样本时表现更优。总体而言，这项工作建立了一个从原子级结构到功能性临床测定的综合流程，为开发下一代诊断抗体提供了一种可推广的策略。
引言
免疫科学的基础是特定的抗原-抗体识别机制，该机制控制着免疫诊断过程[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。基于抗体的诊断工具和治疗方法由于其卓越的结合亲和力和特异性而在生物医学应用中占据了重要地位。然而，传统的抗体开发仍然受到时间延长（6-18个月）、高成本、在非生理条件下的结构不稳定性和获得功能性抗体的高失败率（>50%）的阻碍[7]。此外，为了提高亲和力和特异性而进行的结构导向的抗体工程仍然面临重大挑战，包括准确预测构象灵活性和可靠的开发性分析[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。
从结构上看，抗原-抗体相互作用通过协同的构象选择和诱导契合机制实现了热力学优化的结合，从而实现了多维动态耦合[1]、[2]、[3]、[4]、[13]。单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为一种强大的工具，能够在接近原子分辨率（3.0–3.5 ?）下解析大分子结构[14]、[15]、[16]，为抗原-抗体相互作用提供了关键的结构洞察[17]、[18]。结构生物学和生物信息学的结合进一步革新了计算表位预测，建立了基于分子动力学的深度学习作为构象表位映射的稳健方法[19]。尽管如此，当前的计算框架仍存在根本性局限，包括过度依赖过于简化的物理化学模型，以及忽视了表位界面处的动态构象转变（≥100 ns）和多体效应[20]、[21]。基于局部连接性、参与桥接相互作用以及在抗原-抗体界面处的邻近性来界定拓扑关键残基，对于阐明结合机制和实现合理抗体设计至关重要[22]。因此，利用计算算法的结构导向设计为在分子水平上优化抗原-抗体相互作用提供了有希望的途径，从而提高结合亲和力和特异性。
C-反应蛋白（CRP）主要由肝细胞在组织损伤或微生物入侵引发的促炎条件下合成[23]、[24]，它是临床炎症监测的关键生物标志物[25]、[26]。高度敏感的CRP（hs-CRP）测定方法的发展揭示了低浓度升高与动脉粥样硬化的亚临床进展[27]、胰岛素抵抗[29]和肿瘤微环境重塑[30]、[31]之间的显著相关性。我们之前对四种不同的CRP-重链抗体（HCAb）复合物（PDB：9KMP、9K94、9JO9、9JO7）的结构测定[32]揭示了亲和力的异质性，并提供了它们特异性识别的机制见解。HCAb1中的R99、N101和D103；HCAb2中的S55、G56和R101；HCAb3中的R33、Q55和N59；以及HCAb4中的R33、R57、R99和N101被确认为抗原-抗体结合亲和力的关键决定因素。这些发现表明，针对这些残基的结构导向优化结合计算饱和突变可以显著提高抗体的亲和力和特异性。
为此，我们提出了一个综合的抗体优化流程，包括：（i）识别介导抗原-抗体识别的关键拓扑残基；（ii）结构导向的互补决定区（CDRs）优化；（iii）结合CDR衍生肽的分子动力学模拟和实验分析；（iv）表达抗体突变体，随后进行分子动力学验证和体外功能测定。结果产生的抗体与其野生型相比表现出增强的结合亲和力和特异性，显示出在临床检测应用中的强大潜力。总体而言，这项研究建立了一个从原子级结构到功能性临床测定的理论和方法论框架，为开发下一代诊断抗体提供了一种通用的策略。
结构导向的计算生物学抗体优化工作流程
为了精确优化抗体的亲和力和特异性，我们采用了一种结合拓扑残基分析和计算饱和突变的结构导向计算设计策略。我们的方法包括三个关键步骤（图1）。首先，我们基于接近原子分辨率的结构架构确定了控制特定识别的关键拓扑残基，为抗原-抗体相互作用提供了机制见解（图1a）。其次，我们进行了...
讨论
高性能抗体的合理设计仍然是诊断开发中的关键挑战[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。在这项研究中，我们建立了一个从原子级结构洞察到临床级测定验证的全面结构导向框架，用于工程化具有优异结合亲和力和特异性的抗CRP抗体。我们的方法将结构生物学与计算设计和功能筛选相结合，以克服关键限制...
CDR衍生肽的设计和对接研究
从蛋白质数据库获得了四种CRP-重链抗体（HCAb）复合物的晶体结构：9KMP、9K94、9JO9、9JO7。基于这些结构，设计了针对CRP抗原的核心表位残基的肽，这些表位残基与HCAbs的互补决定区（CDR）环发生多种极性相互作用。所有CDR衍生肽均通过GenScript（南京，中国）进行N端生物素连接，以便后续的验证测定。
CRediT作者贡献声明
李一健：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、调查、形式分析、数据管理、概念化。
刘同功：调查、形式分析、数据管理。
王静哲：可视化、数据管理。
赵晓娜：可视化、调查、形式分析、数据管理。
文杰：调查、数据管理。
李忠岩：调查、数据管理。
曾福兴：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、资金筹集、概念化。
顾大勇：
资助
本研究得到了以下机构的支持：国家关键研发计划[2022YFC2302700]；国家卫生健康委员会医院管理研究所项目[JCWJ2024ZD01, JYHRXZ2025B49]；国家卫生健康委员会医疗健康技术发展研究中心的临床研究专项项目[WKZX2024DN0181]；广东省科学技术基金[2023B0101200003, 2023B110008, 2022B1111020001, 2021A1515220084, 2020JD076]；深圳市
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
F.Z. 是深圳科技大学生物电子显微镜研究所的研究员。我们感谢南方科技大学的冷冻电镜中心提供的冷冻电镜访问和培训服务，以及南方科技大学的核磁共振设施提供的超速离心支持。
