《Computational Biology and Chemistry》：DoTT-ML: condition-aware detection of transcriptional readthrough from RNA-seq with optional ML-based prioritization
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本研究开发DoTT-ML pipeline，用于检测转录终止失调事件，支持多条件比较，整合差异分析和机器学习模块，验证其在病毒感染和小鼠代谢应激模型中的有效性，实验证实Scd1位点的稳定读through转录。
迈克尔·莱文（Michael Levin）|艾赞·苏伦巴耶娃（Aizhan Surumbayeva）|李迈克（Max Li）|伊戈尔·阿斯特萨图罗夫（Igor Astsaturov）|周云云（Yunyun Zhou）
美国宾夕法尼亚州费城天普大学工程学院生物工程系
摘要
当RNA聚合酶II读取超过基因的正常3′端时，就会发生转录终止中断（DoTT），从而产生下游的“通读”RNA。在病毒感染和代谢紊乱等压力条件下，已经观察到DoTT现象。然而，许多现有的检测工具一次只能分析一个样本，或者依赖于固定的下游窗口，这限制了直接的条件间比较测试。我们提出了DoTT-ML，这是一种能够识别常规短读长RNA-seq中转录终止中断的方法。该流程通过可调的窗口扩展基因注释范围，应用可选的间隙来减少终止附近的噪声，并使用稳健的统计工作流程进行条件间的差异分析。当有经过整理的参考注释时，还可以使用机器学习方法进行事后优先级排序。我们在三个公共数据集上对DoTT-ML与ARTDeco和DoGFinder进行了基准测试：甲型流感病毒总RNA-seq、HSV-1新生4sU-RNA和HSV-1 Z-RNA RIP-seq。结果表明，DoTT-ML的性能与现有工具相当或更优（在所有数据集中的ROC AUC值均较高）。最后，在一个内部构建的小鼠高碳水化合物饮食（HCD）肝脏模型中，DoTT-ML检测到了与饮食相关的代谢基因通读现象。实验验证证实，在饮食压力下Scd1位点存在稳定的通读转录本，这证明了该流程的生物学相关性。总体而言，DoTT-ML为跨不同RNA-seq实验的条件感知通读检测和比较提供了一个实用的框架。
引言
转录终止是一个关键的调控步骤，确保RNA聚合酶II在正确的基因组位置停止转录。这定义了基因边界，并防止对下游基因的干扰（Richard和Manley，2009）。当RNA聚合酶II未能正确终止转录时，就会发生转录终止中断（DoTT），导致通读转录本延伸超出基因的正常3′非翻译区（UTR）和多聚腺苷酸化位点。这些异常转录本可能渗入基因间区域或与邻近基因重叠，甚至可能形成双链RNA并干扰基因调控（Rosa-Mercado等人，2021）。
DoTT事件在多种生物学背景下都有观察到。例如，严重的渗透压胁迫会触发哺乳动物细胞中的广泛转录通读（Vilborg等人，2015）。在溶源性HSV-1感染期间，大多数宿主基因表现出不受控制的转录通读现象。Henning等人（2018）和Rutkowski等人（2015）将这种现象称为“DoTT”（Hennig等人，2018；Rutkowski等人，2015）。异常终止还与癌症有关：在具有SETD2突变的肾细胞癌中，转录常常会远远超出正常基因末端（Grosso等人，2015）。这些发现表明，终止失败可能发生在压力、感染或疾病条件下，通常伴随着异常RNA的形成和先天免疫途径的激活（Boudreault等人，2019；Hadar等人，2022；Hennig等人，2018；Mei等人，2025）。然而，标准的RNA-seq分析流程主要关注已注释的基因区域，因此常常会错过这些非典型的转录本，这凸显了需要专门的检测方法。尽管先进的新生转录本测序技术（如NET-seq、GRO-seq）可以分析转录通读（Wissink等人，2019），但这些技术需要专门的实验。实际上，需要一种计算机模拟方法从常规RNA-seq数据中检测DoTT事件（Adiconis等人，2018；Wang等人，2009）。
已经开发了几种计算工具来解决这一需求。DoGFinder（Wiesel等人，2018）通过搜索基因边界下游的连续RNA-seq信号来识别“基因下游”（DoG）转录。Dogcatcher（Melnick等人，2019）使用滑动窗口方法从短读长RNA-seq中检测和量化基因下游转录。Readon（Chen等人，2024）使用最小化草图算法检测转录本延伸，最初是为长读长测序数据开发的。ARTDeco（Roth等人，2020）通过测量读段在基因末端周围的分布来估计通读和相关终止缺陷。虽然这些工具对通读现象的统计分析很有价值，但它们对直接的条件间比较测试的支持程度各不相同。例如，DoGFinder必须对每个样本单独运行，然后才能推断条件间的差异。由于DoGFinder没有内置的差异测试功能，因此很难识别出统计上显著的、条件特定的终止缺陷，尤其是在效应微妙或重复结构重要的情况下。在具有生物学重复样本或微妙通读效应的研究中尤为如此（Caldas等人，2024）。此外，现有的短读长工具也存在实际限制，这些限制取决于数据集。DoGFinder不报告统计显著性，并且对噪声较大的下游信号敏感。ARTDeco包含差异表达模块，但其通读结果取决于基因末端和下游窗口的定义，在基因密集区域或非常短的延伸情况下可能会遇到挑战。值得注意的是，在某些病毒背景下，这包括进入基因末端附近的重复元素（如Z型反向重复序列）的通读。综上所述，这些挑战促使我们开发了一种条件感知方法，该方法在可用重复样本的情况下使用重复样本，适应不同类型的数据，并提供可调的参数用于通读检测。
在这里，我们介绍了DoTT-ML，这是一种计算流程，通过整合注释扩展、条件感知的差异分析和可选的机器学习优化来检测总RNA-seq中的DoTT事件。DoTT-ML将基因注释向下扩展一定的长度，并引入一个可配置的间隙参数，以区分真正的通读和接近末端的信号以及潜在的下游“读入”转录。DoTT-ML使用稳健的差异表达框架（DESeq2，包括过滤和加权）来识别在一种条件下比另一种条件下下游转录显著增加的基因。对于有经过整理的DoTT真实数据集，该流程还可以选择应用随机森林分类器。模型通过交叉验证进行训练和评估，并使用SMOTE来处理类别不平衡问题（Breiman，2001；Chawla等人，2002）。这为统计上被推荐的候选者提供了额外的置信度排序。我们使用了三个公开的病毒感染数据集（已知会发生DoTT事件）来对比DoTT-ML与现有工具的性能。我们还使用了一个内部构建的高碳水化合物饮食（HCD）与禁食小鼠肝脏模型来展示该流程在代谢压力环境中的表现，并通过实验验证了一个代表性的通读事件。我们的结果表明，DoTT-ML流程适用于多种实验环境，能够在总RNA、新生RNA和RIP-seq数据中检测到终止失败，并提供关于条件特定转录通读的生物学见解。
数据来源和软件实现
我们分析了多个真实的RNA-seq数据集，这些数据集涵盖了不同的实验背景，以开发和评估该流程。（1）小鼠高碳水化合物饮食（HCD）模型：这个内部数据集包括处于高碳水化合物饮食状态下的小鼠肝脏RNA-seq，以及禁食对照组（每组5个生物学重复样本）。该模型在肝脏中诱导代谢压力，假设在HCD条件下会发生DoTT事件。（2）HSV-1感染（4sU标记的新生RNA）: 我们获得了...
DoTT检测的扩展长度优化
使用HSV-1感染数据集，我们对不同的扩展长度进行了敏感性分析。我们将流程运行在从基因末端起0.5 kb到10 kb的扩展窗口范围内，并根据HSV-1诱导的DoTT基因的整理代理标签评估了性能。图2总结了这一分析的结果。我们观察到，非常短的扩展长度（0.5–1 kb）往往不足以捕捉到完整的通读信号，导致灵敏度较低。
讨论
在这项研究中，我们提出了DoTT-ML，这是一种能够从短读长常规RNA-seq数据中检测转录终止故障的条件感知流程，该流程包含一个可选的基于机器学习的候选者优先级排序模块。通过向下扩展基因注释并整合差异分析及可选的机器学习分类器，DoTT-ML填补了在实验条件下比较识别通读（DoTT）事件的方法学空白。
结论
我们开发了DoTT-ML，这是一种条件感知流程，结合了扩展区域读段计数、条件间的差异测试以及可选的监督排序步骤，用于从短读长RNA-seq中检测转录终止通读（DoTT）。在分析的基准数据集中，DoTT-ML在代谢压力模型（小鼠肝脏）和病毒感染环境（人类细胞）中都检测到了与条件相关的通读信号。可选的随机森林组件被用作...
资助
这项工作部分得到了天普大学内部资金的支持，包括2025年夏季为迈克尔·莱文提供的研究生研究奖学金。没有外部联邦资金（例如NIH、NSF或DoD）直接支持该项目。
CRediT作者贡献声明
迈克尔·莱文：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、软件开发、方法论设计、数据整理、概念构思。艾赞·苏伦巴耶娃：验证。伊戈尔·阿斯特萨图罗夫：验证、监督、资源管理、项目协调、调查。周云云：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、项目协调、方法论设计、调查、概念构思。李迈克：撰写 – 审稿与编辑、概念构思。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这份手稿时，作者使用了生成式AI工具ChatGPT（OpenAI）来帮助澄清措辞和改进文本语法。该工具的使用遵循了Elsevier关于负责任AI使用的指南：所有由AI生成的建议都经过了作者的仔细审查、验证和编辑。AI没有创建任何新的科学内容，作者对手稿的准确性和完整性负全责。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
我们感谢Zhou和Astsaturov实验室的成员对这项工作的有益讨论和反馈，以及天普大学和Fox Chase癌症中心的HPC团队的计算支持。同时，我们也感谢A. Rutkowski博士和C. Yin博士提供的HSV-1数据集，以及S. Roth博士提供的IAV数据集。
代码可用性
DoTT-ML的源代码（Python和R）在GitHub上以MIT许可证公开发布，同时提供了依赖项规范（environment.yml、requirements.txt）等文件。
