《Fungal Biology》：Artificial inoculation of native endophytic fungi and
Epichlo? in
Bromus valdivianus Phil.: successful establishment and growth promotion
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人工接种智利翦股颖（Bromus valdivianus）与两种真菌（Epichlo? uncinata和Penicillium sanguifluum）及五个本地非丛梗孢科内生真菌，验证其定殖成功及对农艺性状的促进作用，发现接种显著提升株高、分蘖数和干生物量，并证实Emichlo? uncinata和Penicillium sanguifluum 012BV的代谢物（如133 μg/mL生物碱）对宿主有显著正向效应。
Jorge A. Luna-Fontalvo | Maximiliano Riquelme | Oscar Martínez | Oscar Balocchi
智利南部大学（Universidad Austral de Chile）农业与食品科学学院研究生院，瓦尔迪维亚 5090000，智利
摘要
本研究首次成功实现了对*Bromus valdivianus*的人工接种，接种了*Epichlo? uncinata*以及五种非Clavicipitaceae科的本土真菌，从而为智利南部牧草的生物接种剂开发开辟了新的途径。通过种子切口法和叶面喷洒法，在受控条件下评估了接种成功率、真菌代谢产物的产生以及对关键农艺性状的影响。所有接种的植物均表现出较高的存活率，并且组织接种成功，这一点通过重新分离、麦角固醇定量和显微镜观察得到了证实。值得注意的是，*Penicillium sanguifluum* 012BV和*Epichlo? uncinata*的接种效果最佳（接种率为84%）。色谱分析显示，*E. uncinata*产生了大量的生长素和生物碱，其中包含133 μg/mL的利oline型生物碱。与对照组相比，接种后的植物在株高、分蘖数、叶片发育和干生物量方面均显著增加，且这些变化具有菌株特异性。这些发现证明了在本土草种中进行人工内生菌接种的可行性和农艺潜力。*P. sanguifluum*和*E. uncinata*的优异表现凸显了它们作为生物接种剂在可持续牧草生产中的价值，对气候变化下的草地恢复力具有重要的意义。
引言
内生真菌的定义是它们能够在不引起可见损伤或症状的情况下系统性地定殖于植物组织中（Liao等人，2025年）。这些微生物具有丰富的分类多样性，并能促进宿主的营养吸收，增强其对生物和非生物胁迫的抵抗力。这些益处是通过产生生物活性化合物实现的，包括生物碱、植物激素、有机酸、抗氧化酶、氨基酸和蛋白质（Wang等人，2020年；Lee等人，2021年；Zhou等人，2021年）。这种互惠关系在农学研究中受到了越来越多的关注，尤其是在牧草生产系统中。
内生真菌传统上根据生活方式、传播方式、系统发育关系、宿主范围和生态功能被分为两大类：Clavicipitaceae和非Clavicipitaceae（Rodríguez等人，2009年；Uzma等人，2019年）。属于Clavicipitaceae类的内生真菌主要定殖于草本植物，并通过种子垂直传播给后代，其中*Epichlo?*属的物种是该类的代表。相比之下，非Clavicipitaceae类内生真菌种类繁多，根据其定殖和传播策略的不同被进一步划分为第2、3和4类。第2类内生真菌既定殖地上部也定殖地下组织；第3类主要定殖于地上植物组织；第4类则是与根系相关的内生真菌，常被称为暗隔内生真菌。它们主要属于子囊菌门和担子菌门，能够定殖于非维管植物的地上和地下组织、裸子植物和被子植物。这些内生真菌具有广泛的功能多样性，可以通过垂直和水平方式传播（Rodríguez等人，2009年；Liao等人，2025年）。
内生真菌在农学实践中具有重要意义，因为它们对宿主的表现有多方面的积极影响。*Epichlo?*属物种与高价值牧草（如*Festuca arundinacea*和*Lolium perenne*）之间的共生关系已被广泛研究。此外，还有报道指出*Epichlo?*与几种南美洲*Bromus*属植物之间存在自然关联（Johnson等人，2013年；Iannone等人，2017年；Iannone等人，2021年）。同样，一些非Clavicipitaceae类内生真菌（如*Beauveria bassiana*、*Chaetomium subaffine*、*Metarhizium anisopliae*和*Trichoderma*属物种）也被研究其在农作物害虫和病原体生物防治中的作用，以及它们产生生物活性代谢产物的潜力（Kandula等人，2015年；Kuzhuppillymyal-Prabhakarankutty等人，2020年；Nischitha和Shivanna，2022年；Nischita，2024年）。
内生真菌的农业潜力促使人们从多种宿主物种和群体中分离、筛选并接种真菌菌株。由于它们的腐生生活方式，许多内生真菌可以被培养和繁殖，以生产适用于相应宿主的接种剂（Becker等人，2018年）。因此，人工接种已成为一种有前景的生物技术策略，有助于促进禾本科（Poaceae，也称为真草）植物之间的共生转移，加深了对植物-真菌相互作用的理解，并为牧草作物改良提供了新途径（Kauppinen等人，2016年；Lugtenberg等人，2016年）。Latch和Christensen（1985年）开发的无菌幼苗切口接种方法为内生菌感染草类的商业化生产奠定了基础。大量研究表明，接种后的植物在生长、抗逆性和生产力方面均有所提高（Kauppinen等人，2016年；Zhang等人，2025年）。
人工接种技术为培育能够抵御当前农业挑战（尤其是气候变化和日益增加的生物与非生物压力）的草品种提供了有效方法（Simpson和Mace，2012年）。这一策略对于经济上重要的牧草（如*Bromus*属物种）尤为重要，因为自然感染*Epichlo?*内生真菌的情况仅在少数物种中得到记录。最近对*Bromus valdivianus*的研究发现，该物种与多种本土内生真菌存在共生关系；然而，尚未检测到*Epichlo?*属的任何成员，这凸显了我们在理解其共生潜力方面的知识空白（Luna-Fontalvo等人，2026年）。迄今为止，尚无研究通过实验验证多倍体草*B. valdivianus*是否可以通过人工接种建立与*Epichlo?*内生真菌的功能性共生关系。解决这一空白对于确定该牧草品种是否能通过内生菌提高抗逆性和农艺表现至关重要。
*Bromus valdivianus* Phil.（属于*Ceratochloa*组）是智利南部主要牧草物种之一，是永久性草地的重要组成部分。这种多年生草具有快速生长和耐旱的特点（López等人，2025年）。其高蛋白质含量（干物质中超过20%）使其成为智利南部奶牛和牛肉生产系统的重要且经济可行的饲料来源（Calvache等人，2021年；García-Favre等人，2023年）。然而，环境压力、病原体侵害和食草动物可能会限制其生产力，而与内生真菌的有益共生关系可能有助于缓解这些挑战。
尽管*B. valdivianus*在农学上具有重要意义，但对其内生真菌共生关系的了解仍然有限。尽管最近发现了与该物种相关的本土内生真菌，但尚未发现*Epichlo?*属的成员。此外，*Ceratochloa*组物种的多倍体特性被认为可能是其与*Epichlo?*内生真菌建立稳定共生关系的潜在限制因素（Williams等人，2011年；Franco等人，2015年）。目前尚不清楚这一基因组特性是否真的限制了*B. valdivianus*与*Epichlo?*之间的兼容性，因为这一点尚未通过实验进行验证。此外，也尚未探索用本土真菌菌株接种该物种的潜力——由于共同进化适应，这些菌株可能更具兼容性。
鉴于内生真菌对宿主表现的多方面贡献，本研究旨在评估在*Bromus valdivianus*中建立功能性共生关系的可行性。我们假设，用本土内生真菌和*Epichlo?*菌株进行人工接种能够实现成功的定殖，并改善植物的形态特征和生长情况。同时，我们认为由于来源和代谢谱的差异，不同的内生真菌和*Epichlo?*菌株的效果可能会有所不同。为此，我们分析了本土内生真菌和*Epichlo?*菌株产生的生长素和生物碱；在受控条件下评估了它们在*B. valdivianus*中的定殖情况；并评估了这些接种对植物存活率和生长表现的影响。
植物和真菌材料
*Bromus valdivianus* cv. Bronco的种子从商业供应商处获得。两种*Epichlo? uncinata*菌株（001LP和002LP）来自自然感染的*Lolium perenne*种子，而五种本土内生真菌菌株则来自之前关于*B. valdivianus*的研究。这些真菌菌株的分类学身份通过形态特征和基于rDNA-ITS、β-微管的分子系统发育分析确定。
内生真菌产生的生长素和生物碱
初步分析表明，在添加色氨酸的麦芽提取物培养基中培养的六种内生真菌菌株中有四种产生了生长素（图2A）。其中，*Trichoderma koningiopsis* 005BV产生的生长素最多，达到7.40 ± 0.47 μg吲哚-3-乙酸当量/毫升。相比之下，*Beauveria bassiana* 006BV在阳性菌株中的生长素浓度最低（0.96 ± 0.49 μg/毫升）。
菌株001BV（*Chaetomium subaffine*）和041BV（*T. harzianum）
讨论
宿主植物与内生真菌之间成功建立功能性共生关系是发挥其互惠作用的关键第一步。本研究表明，对*Bromus valdivianus*进行人工接种，无论是Clavicipitaceae类（*Epichlo? uncinata*）还是非Clavicipitaceae类本土内生真菌，不仅可行，而且能够显著促进植物生长。这些结果支持了最初的假设，并验证了人工接种的有效性。
结论
本研究表明，对*Bromus valdivianus*进行*Epichlo? uncinata*和本土非Clavicipitaceae内生真菌的人工接种是一种可行的策略，能够促进植物生长。通过显微镜、生化和生理方法证实的成功定殖证明了共生体与宿主的兼容性。不同菌株对植物生长的促进作用存在差异，其中*E. uncinata*和*P. sanguifluum* 012BV在形态学方面的效果最为一致和显著。
CRediT作者贡献声明
Oscar Balocchi：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取。
Oscar Martínez：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资金获取、概念构思。
Maximiliano Riquelme：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资金获取、概念构思。
Jorge Alberto Luna Fontalvo：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究、数据分析、数据管理、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
作者衷心感谢智利国家研究与发展机构（ANID）通过Fondecyt项目“Bromus在智利南部草地生物多样性中的作用”（项目编号Fondecyt 1220448）对本研究的资助。
