《International Journal of Biological Macromolecules》：Machine learning-assisted engineering of substrate-specific β-lactamases
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酶定向进化中利用机器学习构建反筛选模型，通过正筛选数据训练卷积神经网络预测β-内酰胺酶对氨苄西林的残余活性，结合对头孢他啶和头孢噻肟的选择，实现底物特异性调控。
作者：Ye Seop Park, Chang Beom Jeong, Minju Kim, Daeun Kim, Daechan Park, Tae Hyeon Yoo
韩国水原市16499，Ajou大学分子科学与技术系
摘要
定向进化是一种调整酶底物特异性的强大策略，但通常需要通过阴性筛选或选择来消除对不需要的底物仍具有活性的变体。在这里，我们提出了一种基于机器学习的工作流程，用针对不需要的底物的阳性选择数据训练的计算机模拟阴性过滤器来替代实验性的反向选择。以具有广泛底物特异性的TEM-52 β-内酰胺酶为模板，我们对六个活性位点残基进行了随机改造，构建了一个约4×108个成员的库。通过两轮氨苄西林（AMP）选择和下一代测序得到的数据，我们训练了一个卷积神经网络，该网络能够根据序列预测酶对AMP的活性。然后我们对头孢他啶（CAZ）进行了选择，并将训练好的模型应用于目标富集的池中，优先筛选出预测为对AMP无活性的变体。这一过程产生了在CAZ中支持细胞生长但在AMP中无活性的变体，并且这些变体在动力学检测中对AMP没有表现出可检测的活性。将该方法扩展到结构与AMP更相似的头孢噻肟（CTX）和头孢噻吩（CET）上，得到的对AMP无活性的候选变体较少，并且序列解决方案显示出部分收敛性。跨底物分析进一步明确了特异性：在CAZ中选择的变体对CTX和CET基本上无活性，而在CTX/CET中选择的变体在这一头孢菌素亚组内往往表现出重叠的活性。更广泛地说，只要能够为不需要的目标生成序列到活性的数据，本研究提出的策略就可以应用于其他蛋白质，从而实现可扩展的酶定向工程。
引言
酶通常以其底物特异性来描述，然而许多天然酶可以催化多种底物的反应，甚至具有多种化学性质——这种现象通常被称为酶的广谱性。广谱性可以通过提供潜在的活性来增强生物系统的鲁棒性，并在进化过程中促进新酶功能的出现[1]、[2]、[3]、[4]。在蛋白质工程中，这些潜在的活性经常被用作多样化催化库和实现自然界中不存在的转化的起点[5]、[6]、[7]。
尽管具有这些优势，但在应用场景中广谱性往往是不希望出现的。在代谢工程中，非目标反应可能会使代谢流偏离目标产物，产生有毒副产物，或使代谢途径平衡变得复杂[8]、[9]、[10]。同样，基于酶的传感器在存在结构相关的分析物时可能会产生交叉反应信号，从而降低诊断的特异性[11]、[12]、[13]、[14]。这些挑战催生了酶定向性的概念，即在复杂的生物环境中将催化活性有效地限制在预期的底物（或底物类别）上。实现这种定向性仍然是生物催化、合成生物学、诊断和治疗应用中的核心目标[15]、[16]、[17]。
已经开发了多种酶工程策略来减轻广谱性问题[18]、[19]、[20]、[21]。其中，定向进化（DE）是一种核心方法：通过迭代进行突变和筛选（或选择），以提高对目标底物的活性，同时抑制不必要的活性，通常结合使用正向和负向筛选。然而，阴性筛选可能成为一个实际的限制因素。对于许多酶来说，设计能够可靠地惩罚非目标活性的可扩展检测方法是非常具有挑战性的，尤其是在存在多个竞争底物的情况下。即使有这样的检测方法，它们也会增加实验负担并可能减缓迭代优化的速度[22]、[23]、[24]。此外，蛋白质库中庞大的序列空间仍然是高效定向进化的主要障碍[25]、[26]。
机器学习（ML）作为一种强大的补充手段，可以从经验测量中学习基因型-表型关系，并优先选择用于实验测试的变体[27]、[28]。基于ML的定向进化已经在多种酶和反应中取得了显著进展，包括实现自然界中不存在的催化作用以及提高活性和稳定性[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。然而，使用ML辅助的工作流程来工程化底物特异性的成功案例相对较少[35]、[36]。
在这里，我们提出了一种基于ML的策略，通过计算过滤掉具有不需要的活性的变体来工程化酶的特异性（图1）。首先，我们选择一个针对不需要的底物的酶库，并在得到的数据上训练一个ML模型来预测非目标活性。这个模型被称为计算机模拟阴性过滤器，用于估计一个变体在不需要底物上保持活性的可能性。同时，同一库还会针对目标底物进行选择。通过阴性过滤器评估目标选择中富集的变体，从而去除那些预测为仍然具有非目标活性的变体，从而避免依赖实验性的阴性筛选。我们通过构建一系列底物特异性改变的TEM β-内酰胺酶变体来演示这种方法。
部分内容摘要
质粒构建
使用引物1–4（表S1）从pET21a扩增TEM-1 β-内酰胺酶，并通过
II和I限制位点将其克隆到pBbA6c中，得到pSPEL632（图S1）。使用引物3和4在TEM-1基因的3′端引入了一个BamHI位点。为了构建TEM-52，使用引物1、2和5–8通过组装PCR将三个残基（E104、M182和G238）分别突变为E104K、M182T和G238S。然后将所得扩增子通过II和I限制位点克隆到pSPEL632中以广谱性β-内酰胺酶（TEM-52）为模型进行底物特异性工程
TEM β-内酰胺酶可以降解β-内酰胺类抗生素（如青霉素和头孢菌素），从而导致多种细菌菌株对抗生素产生抗性[40]、[41]。TEM-1是最早被发现的变体[40]，常被用作含有氨苄西林（AMP）培养基中的选择标记物，AMP是一种代表性的青霉素类抗生素（图2A）。TEM-1对头孢菌素的活性有限；然而，后来能够降解第三代头孢菌素的变体被归类为
结论
在这项研究中，我们解决了定向进化中一个反复出现的瓶颈问题：从富集了目标底物的池中去除广谱性变体。我们没有开发额外的阴性筛选或选择方法，而是使用针对不需要的底物的阳性选择数据训练了一个ML模型，并将其作为计算机模拟反向选择过滤器。以具有广谱性的TEM-52 β-内酰胺酶为模型，我们构建了一个大型活性位点库
CRediT作者贡献声明
Ye Seop Park：概念化、数据整理、方法论、研究、数据分析、初稿撰写、审稿与编辑。Chang Beom Jeong：方法论、研究、数据分析、初稿撰写、审稿与编辑。Minju Kim：数据整理、方法论、数据分析。Daeun Kim：数据整理、方法论、研究、数据分析、初稿撰写。Daechan Park：数据整理、方法论、数据分析、研究、资金支持
资金来源
本研究得到了韩国政府资助的国家研究基金会的生物与医学技术发展计划（RS-2023-00285390、RS-2024-00439931和RS-2025-23,323,220）的支持。
