一种快速且高度敏感的CRISPR-Cas12a同源物辅助检测方法，用于肌抑素敲除猪的基因分型

《Cell & Bioscience》：A rapid and highly sensitive CRISPR-Cas12a ortholog-assisted assay for genotyping of myostatin knockout pigs

　　

摘要

CRISPR技术极大地改变了基因组编辑和下一代核酸检测的方法。在这项研究中，我们鉴定了一种Cas12a同源物Gs12-9（EsoCas12a），它能够识别一种广泛的PAM基序（NYYN，其中Y代表C或T），并在广泛的温度范围（16–60 ℃）内保持强大的顺式和反式切割活性，其性能优于已知的Cas12a变体（如LbCas12a）。利用Gs12-9，我们建立了一个快速、高灵敏度且耐温的核酸检测平台，无需严格的热控制即可实现精确的基因分型。通过将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Gs12-9介导的检测方法相结合，我们能够准确区分肌抑素（MSTN）敲除猪和野生型个体，检测限达到每次反应40个拷贝，准确率为100%。虽然在这项工作中MSTN敲除（KO）猪被用作概念验证模型，但Gs12-9的多功能性使其在基于CRISPR的诊断应用中具有更广泛的应用前景，包括病原体筛查和遗传变异检测。