利用工程化荧光适配体探针实现微尺度热泳检测凝血酶，该方法具有高灵敏度和显著的反应信号

《Microchemical Journal》：Microscale thermophoresis detection of thrombin with sensitive and large responses by using an engineered fluorescent aptamer probe

凝血酶检测方法创新：基于工程化荧光aptamer的微尺度热迁移技术，通过优化aptamer序列、茎长及荧光标记位置，实现0.31 nM超低检测限，并成功应用于血清样本检测。

　　

韩庞|赵强

中国科学院生态环境科学研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京100085，中国

摘要

凝血酶是凝血级联反应中的关键因子，作为多种疾病预后、诊断和监测的重要生物标志物。在许多领域中，对凝血酶的敏感快速检测是必要的。在本研究中，我们报道了一种基于适配体的微尺度热泳（MST）方法，该方法使用了一种工程化的荧光适配体探针来检测凝血酶。该适配体传感器在结合凝血酶前后显示出显著的热泳信号差异，从而实现了凝血酶的快速定量检测。为了提高适配体探针对凝血酶的响应性能，我们系统研究了适配体序列、茎区长度、荧光团标记位置和缓冲条件的影响。一种最优的27个核苷酸长度的截短适配体（HD22-27 nt-3′F），其茎区较短，3′端标记有荧光团，能够在凝血酶结合时产生更大的热泳信号。这种由HD22-27 nt-3′F构建的适配体传感器能够以0.31 nM的检测限快速检测凝血酶，并且可以在血清样本中检测到凝血酶。这种策略通过合理设计适配体，为均匀溶液中的蛋白质提供了一种新的快速灵敏检测方法。

引言

凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在病理和生理凝血过程中起着不可或缺的作用[1]，[2]。其浓度决定了其在生理过程中的作用。在正常情况下，血液中的凝血酶浓度从纳摩尔到微摩尔不等，分别对应于正常状态和血液凝固[3]。在病理条件下，凝血酶水平会显著变化[4]。凝血酶是某些疾病的生物标志物[1]，[2]，[3]，[4]。因此，使用快速灵敏的方法定量检测凝血酶在临床诊断和生物分析中非常重要。

适配体是合成DNA或RNA寡核苷酸，是生物传感领域中重要的识别元件，能够以高亲和力特异性结合目标[5]。与抗体相比，适配体具有多个显著优势，如分子量小、成本低、化学合成和功能化（例如标记荧光团）简单、稳定性更高、结合诱导的构象变化以及易于工程化[6]。两种DNA适配体HD1和HD22被选用于凝血酶检测，并得到了广泛应用[7]，[8]。HD1（5′-GGT TGG TGT GGT TGG-3′）采用单分子反平行G-四链结构，含有两个TT环和一个TGT基序[9]，[10]。HD1以约100 nM的解离常数（Kd）结合到凝血酶的exosite 1上，抑制凝血酶的促凝功能[2]。适配体HD22（5′-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3′）对凝血酶具有更高的亲和力，其二级结构为双链/G-四链混合结构[2]，[8]。HD22可以以约0.5 nM的Kd结合到凝血酶的exosite 2上，这有助于肝素结合[8]，[11]。基于这些适配体的适配体传感器已被开发用于凝血酶检测，包括电化学方法、比色测定和荧光传感器，但其中一些方法存在制备和操作复杂、需要固定或分离以及检测时间长的局限性[3]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]。因此，仍需要构建简单快速的适配体传感器来灵敏检测凝血酶。

微尺度热泳（MST）是一种基于红外（IR）激光加热引起的温度梯度下分子迁移的敏感生物物理方法，可以定量生物分子相互作用[19]，[20]，[21]。在MST分析过程中，记录归一化荧光（F norm）信号，该信号是通过加热后的样本荧光强度（F hot）除以加热前的样本荧光强度（F cold）得到的[22]。由于构象、大小和电荷的变化，荧光配体的MST响应可能与目标-配体复合物的不同[23]。尽管MST技术已应用于分子相互作用表征，但它有望用于开发使用荧光配体检测各种目标（如核酸、小分子和蛋白质）的方法[24]，[25]，[26]。与其他方法相比，MST分析具有独特的优点，包括无需固定和分离、样品消耗量小、测量速度快（几秒钟内完成）以及信号比率测量具有高稳健性[21]，[27]。由于制备简单、易于荧光团标记和可编程工程化，适配体配体在基于MST的方法中具有吸引力。尽管MST常用于表征适配体-目标结合，但对某些目标的MST响应较小，这给开发灵敏的MST方法带来了挑战。

在本研究中，我们报道了一种简单灵敏的凝血酶检测MST方法，该方法使用了一种在3′端标记有荧光团（FAM）的合理设计的适配体，显示出显著的响应。适配体和凝血酶-适配体复合物在MST过程中表现出不同的构象变化，因此具有不同的MST响应。我们研究了适配体类型、茎区长度和FAM位置对凝血酶检测的影响。最终发现，3′端标记有FAM的27个核苷酸长度的截短HD22（HD22-27 nt-3′F）在凝血酶结合时显示出更大的MST响应变化。我们使用MST适配体传感器成功检测到了亚纳摩尔级别的凝血酶，并能够在血清样本中检测到凝血酶。本研究证实，通过合理设计荧光适配体的结构，可以显著提高MST测定的分析性能。

材料与试剂

所有带有FAM标记的DNA适配体均由Sangon Biotech（上海）有限公司（中国上海）高纯度制备（见表S1）。人α-凝血酶购自Haematologic Technologies Inc.（佛蒙特州埃塞克斯 junction）。Tris-HCl（1 M，pH 7.5）、链霉亲和素和牛血清白蛋白（BSA）均购自Sangon Biotech（上海）有限公司（中国上海）。γ-球蛋白和溶菌酶购自Sigma（美国）。血红蛋白购自Solarbio（北京，中国）。

使用适配体探针的凝血酶MST方法原理

图1展示了基于适配体的凝血酶MST方法的原理。一种凝血酶适配体在其3′端标记有FAM，它可以与凝血酶结合。与未结合的适配体相比，结合的适配体形成更稳定的二级结构。未结合的和结合了凝血酶的适配体在MST分析中的响应不同，产生不同的荧光时间曲线。因此，通过测量MST信号的变化（F norm）可以检测到凝血酶。

结论

总之，本研究提供了一种基于适配体的灵敏MST方法，用于在均匀溶液中检测凝血酶，该方法使用了一种工程化的、荧光标记的适配体。这种策略实现了无需分离或固定的简单混合过程来快速检测凝血酶。在研究了具有不同DNA序列、茎区长度和FAM位置的适配体后，我们确定HD22-27 nt-3′F是适合用于凝血酶MST检测的适配体。

CRediT作者贡献声明

韩庞：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，实验研究。赵强：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源协调，项目管理，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢中国科学院战略性先导科技专项（XDB0750100）的支持。