针对鲑鱼虱（Lepeophtheirus salmonis）分泌和排泄产物的新型蛋白质组学筛查方法的探索

《Veterinary Microbiology》：Investigation of a novel assay for the proteomic screening of the secretory and excretory products of individual salmon lice Lepeophtheirus salmonis

　　亚历山大·丁迪亚尔|詹姆斯·E·布朗|迈克尔·麦高恩|艾娃·德雷克|凯文·麦克莱恩|多罗塔·安德罗斯库克|威廉·罗伊|安德烈·范|迭戈·罗布莱多|理查德·佩利|克莱尔·乔伊纳|马克·D·法斯特|肖恩·J·莫纳汉
斯特林大学水产养殖研究所，苏格兰斯特林

**摘要**
鲑鱼虱（Lepeophtheirus salmonis）的分泌物质在其寄生鲑鱼宿主的过程中起着核心作用，这些分泌物质通过调节免疫系统和促进摄食来实现这一过程。以往对分泌和排泄产物（SEPs）的研究依赖于混合样本，这阻碍了对个体间差异以及宿主信号响应的评估。本研究开发了一种新的SEP收集方法，可以从单个成年雌性L. salmonis中获取样本，从而能够评估其在暴露于易感宿主（大西洋鲑鱼Salmo salar）或抗性宿主（银鲑Oncorhynchus kisutch）条件海水后的分泌特征。SEP浓度范围为328至1597 μg/mL?1，宿主种类或处理条件对蛋白质产量没有影响。在16个个体中，每次重复实验平均检测到101.4种蛋白质，其中包括61.2种分泌蛋白，表明存在显著的个体间差异。处理条件并未改变蛋白质的丰富度，但处理后的样本在成分上显示出明显差异。经S. salar处理的虱子特异性分泌了40种蛋白质，包括蛋白酶、蛋白酶抑制剂、C型凝集素和唇腺因子，而对照组仅分泌了一种独特蛋白质。经O. kisutch处理的虱子还分泌了额外的蛋白酶、蛋白酶抑制剂、表皮生长因子样蛋白质以及其他潜在的毒力因子。在多种条件下检测到几丁质脱乙酰酶-7和LY6/uPAR结构域蛋白，这些成分之前未被研究过，可能与虱子与宿主的相互作用有关。总体而言，这些发现表明，从个体水平收集SEP是一种可靠且敏感的方法，可用于揭示L. salmonis的分泌组多样性，并检测出混合分析中掩盖的宿主相关因素对寄生虫分泌活性的调节作用。

**1. 引言**
鲑鱼虱（Lepeophtheirus salmonis (Kr?yer, 1837)）是一种外寄生虫，分布于北半球，主要以宿主的黏液、皮肤和血液为食（Pike & Wadsworth, 1999）。它对全球鲑鱼养殖业造成了重大经济负担，仅对大西洋鲑鱼（Salmo salar (Linnaeus, 1758)）养殖业的年损失就高达约7.9亿欧元（Boxaspen et al., 2022）。与其他外寄生虫类似，L. salmonis利用免疫调节性分泌蛋白来促进摄食并帮助其在宿主体内存活。此外，由于L. salmonis在取食过程中造成的开放性伤口，这种免疫调节作用可能使宿主更容易受到潜在致命的继发感染（Braden et al., 2020）。早期研究在L. salmonis的SEP中发现了低分子量蛋白酶和前列腺素E2合成酶，表明这些分泌物参与了血管扩张和免疫调节（Fast et al., 2004, Fast et al., 2003）。后续的体外研究表明，这些分泌物能够抑制鲑鱼白细胞的促炎基因表达和趋化性；而对重组唇腺蛋白的研究进一步揭示了其在抗凝和免疫调节中的作用（Lewis et al., 2014, Piesz et al., 2020, Midtb? et al., 2024a）。尽管使用蛋白质组学方法研究鱼类外寄生虫的分泌/排泄蛋白的案例相对较少，但最近通过LC-ESI-MS/MS技术对枝角类鱼虱Argulus foliaceus的SEP进行了分析，鉴定出少量但功能重要的蛋白质，包括蛋白酶（如胰蛋白酶）、金属蛋白酶（如astacin）、过氧化物酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂（如丝氨酸蛋白酶抑制剂），SignalP软件还预测了一些蛋白质中的分泌相关信号肽（AmbuAli et al., 2020）。

对L. salmonis SEP的蛋白质组学研究还发现了其他潜在的免疫调节蛋白。Hamilton等人（2018）在成年和未成熟L. salmonis的SEP中发现了过氧化物酶等蛋白质，这些蛋白质可能有助于保护L. salmonis免受宿主活性氧的伤害；Serine型内肽酶可能在免疫调节中通过切割宿主蛋白质发挥作用。Dindial等人（2025）利用液相色谱串联质谱（LC MS/MS）技术分析了从L. salmonis若虫中获得的SEP的蛋白质组成，发现了多种潜在的毒力因子，如蛋白酶、过氧化物酶和蛋白酶抑制剂，这些因子与其他外寄生虫使用的类似物质具有同源性，后者参与凝血或白细胞增殖等过程。然而，所有这些研究都依赖于从高密度混合的L. salmonis中提取上清液来获得SEP，无论是否添加了分泌诱导剂（如多巴胺）（Dindial et al., 2025）。Fast等人（2004）虽然采用了一种将单个成年L. salmonis置于多巴胺溶液中25分钟的方案来收集SEP，但该方案主要针对分泌前列腺素E2的特性分析，并且与传统的混合提取方法结合使用。关键在于，没有数据比较这两种方法的效果。虽然混合提取方法可以获取可用的SEP蛋白浓度（例如约31–66 μg/mL?1），并提供多个L. salmonis样本的分泌蛋白概况，但它们无法揭示个体层面的分泌组差异（Fast et al., 2007; Lewis et al., 2014）。因此，L. salmonis分泌组内的个体差异程度仍然不清楚。不同宿主条件和环境因素对L. salmonis分泌组调节的影响程度也未知。此外，以往的混合提取和个体提取方法都需要完全浸没整个L. salmonis或几乎覆盖其腹面，这可能增加粪便污染的风险。

L. salmonis的主要宿主是S. salar，但它也能感染多种鲑鱼，包括Oncorhynchus和Salvelinus属的物种（Fast et al., 2003）。然而，这些物种对L. salmonis感染的抵抗力不同。特别是银鲑（Oncorhynchus kisutch (Walbaum, 1792) 对L. salmonis感染表现出强烈的免疫反应，感染部位炎症细胞增殖增加，且通过壳聚糖感应机制排斥虱子（Sveen et al., 2025, Braden et al., 2023）。Fast等人（2003）还发现，经S. salar或O. kisutch黏液处理的L. salmonis的SEP具有不同的酶谱特征，表明它们对不同宿主的分泌反应存在差异。目前尚不清楚这些差异分泌蛋白的具体身份，也不清楚L. salmonis在易感宿主（如S. salar）和抗性宿主（如O. kisutch）之间分泌组差异的全面范围，这些差异可能揭示鲑鱼对L. salmonis的不同反应机制。先前的转录组研究表明，不同宿主上的虱子活性存在差异，例如半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶L）和丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶）的表达受宿主种类显著影响（Braden et al. 2017 Jan）。

本文开发了一种从单个成年雌性L. salmonis中提取SEP的新方法，旨在（i）揭示个体层面的分泌组差异；（ii）评估暴露于易感宿主（S. salar）和抗性宿主（O. kisutch）条件海水对SEP组成的影响。通过LC–MS/MS和计算机辅助注释分泌蛋白，我们比较了不同处理条件下的蛋白质丰富度、功能组成以及已知和潜在毒力因子的存在情况。

**2. 方法**
2.1. L. salmonis和鲑鱼条件海水的收集
成年雌性L. salmonis从苏格兰Kames Fish Farming Ltd.养殖的成年虹鳟（Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792)）的皮肤上用镊子采集，并转移到苏格兰斯特林的水产养殖研究所，在10°C的充气海水中孵育24小时后再进行实验。O. kisutch条件海水从英格兰Weymouth的环境、渔业和水产科学中心收集。50条平均质量为243.6克的鱼在10°C的海水中孵育约7个月后采集条件海水。S. salar条件海水从苏格兰Machrihanish的斯特林大学海洋环境研究实验室收集。每条鱼约250克，在10°C的海水中孵育48小时后采集条件海水。每个采集点还采集了未经处理的 ambient 海水作为阴性对照。所有条件海水样本及其对应对照样本在使用前均通过0.45 μm过滤器过滤，以减少外来杂质和微生物的污染。

由于不同宿主的处理条件在持续时间、水箱体积/养殖密度和设施位置上存在差异，因此宿主处理之间的对比属于探索性研究，因为溶解代谢物、微生物群落、有机负荷或鱼类生理状态的变化可能独立于宿主种类而存在。

2.2. SEP的收集和提取
孵育24小时后，将虱子用0.45 μm过滤器过滤的海水在10°C下冲洗20分钟以减少外来污染。然后用镊子将每个处理条件下的4只虱子小心转移到无菌12孔组织培养板（Sarstedt, Nümbrecht, Germany）的每个孔中，每孔一只虱子。虱子背部朝上放置，暴露其腹面。接着，向每个虱子的腹侧头部和胸部滴加15 μL的10°C S. salar条件海水、O. kisutch条件海水或两种对照海水之一，形成局限于边缘膜和第三条游泳腿范围内的液滴。不向身体其他部位添加任何液体。这些液体有助于维持皮肤气体交换，并作为后续收集SEP的溶剂。注意避免将液体滴到肛门处，以防粪便污染样本。处理后，虱子在10°C下孵育3小时。

三小时后，将含有虱子的培养板从培养箱中取出，小心从每个虱子的腹侧头部和胸部吸取约12 μL的SEP液体，转移到装有冰块的1.5 mL试管（Eppendorf, Hamburg, Germany）中。随后将虱子放回10°C的充气过滤海水中孵育24小时，评估其存活情况（即运动能力）。

为了去除多余的盐分（如氯化钠）和可能干扰后续液相色谱串联质谱（LC MS/MS）的杂质，以及使可能降解蛋白质的蛋白酶变性，每个SEP样本先用三氯乙酸（TCA）沉淀处理。向每个样本中加入100% TCA溶液，配制成20% TCA溶液，在冰上孵育1小时后，以15,000 x g和4°C离心10分钟以沉淀蛋白质。去除上清液后，用–20°C丙酮洗涤蛋白质沉淀三次，每次洗涤后再次离心。最后用超纯水将每个样本重新稀释至10 μL。

2.3. 蛋白质定量和SDS PAGE
使用Nanodrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）的A280功能测定蛋白质浓度。选择A280是因为样本体积小，且采用TCA沉淀后用丙酮洗涤可以减少盐分残留。使用相同处理的阴性对照海水（即经过相同沉淀和洗涤步骤的对照介质）进行空白校正。蛋白质浓度数据（μg/mL?1）通过双向ANOVA进行分析，固定因素为鲑鱼种类（S. salar vs. O. kisutch）和处理条件（对照 vs. 条件海水）。通过Shapiro-Wilk检验验证数据的正态性，通过Levene检验验证方差的齐性。

将样本标准化至总蛋白质浓度为250 μg/mL，确保有足够的体积用于后续分析。为了评估蛋白质质量，样本进行了十二烷基硫酸钠凝胶电泳（SDS PAGE）。SEP蛋白样品用4倍Laemmli缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国）以1:3的比例稀释，然后在100°C下加热5分钟，并在4°C和13,000 x g的条件下离心，以准备进行凝胶电泳。每个缓冲样品取10 μL，加入到15孔SurePAGE 10×8 bis-tris凝胶（GenScript，Piscataway，美国）中，同时加入1 μL双色蛋白标准品（Bio-Rad，Hercules，美国）和阴性对照，包括两个鲑鱼处理过的水样及其对应的未处理对照。凝胶在200 V下运行40分钟后，用超纯水冲洗，并在含有40%乙醇和10%醋酸的超纯水中过夜固定。随后按照制造商的说明使用SilverQuest（Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国）试剂盒进行银染，并立即成像。所有SEP蛋白样品随后被立即冷冻在-80°C，然后转移到苏格兰Penicuik的Moredun研究所进行LC MS/MS分析。

2.4. LC MS/MS和计算机模拟分析
样品使用S-Trap微柱（Protifi）试剂盒按照制造商的说明进行消化。简要来说，将1–2 μg的样品与提供的2X SDS裂解缓冲液混合，蛋白质用5 mM Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）还原，并用20 mM甲基甲硫磺酸（MMTS）烷基化。然后用2.5%磷酸酸化蛋白质，并将其结合到S-Trap柱上，使用6体积的S-Trap结合/洗涤缓冲液（100 mM TEAB在90%甲醇中）。柱子以4000 x g离心30秒，然后再用洗涤缓冲液洗涤4次。蛋白质使用序列级胰蛋白酶（在50 mM TEAB中）以1:10的比例与捕获的蛋白质一起在37°C下消化16小时。胰蛋白酶肽分三步洗脱：首先用40 μL 50 mM碳酸氢三铵（TEAB）缓冲液，接着用40 μL 0.2%甲酸（FA），最后用40 μL 50%乙腈（ACN）在水中和0.2% FA。洗脱液汇集后用真空干燥器干燥。干燥后的肽在质谱分析前用20 μL 0.1% FA重新溶解。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析使用Vanquish Nano-LC系统（Thermo Fisher Scientific）与Q-Exactive Plus质谱仪（Thermo Fisher Scientific）联用进行。LC系统配备了Acclaim Pepmap nano-trap柱（C18 PepMap100，300 μm × 5 mm，5 μm，100 ?，Thermo Fisher Scientific）和Acclaim Pepmap RSLC分析柱（C18，100 ?，75 μm×50 cm EasySpray，Thermo Fisher Scientific）。胰蛋白酶肽以20 μL的体积在60 μL/min的等速流下加载到捕获柱上，然后在Easy Spray分析柱上分离。使用的洗脱液为0.1% v/v FA（溶剂A）在H2O中和80% v/v乙腈在0.1% v/v FA（溶剂B）中。梯度从（i）0–95分钟，1–35% B；（ii）95–115分钟，99% B，持续110分钟。数据以正模式采集，MS1扫描在m/z 380–1500的质量范围内进行，分辨率设置为280,000，AGC为3e6，最大IT时间为50 ms。在每个循环中，选择电荷状态≥2且强度阈值≥2.0e4的15个最强离子进行MS/MS，并在30%的标准化碰撞能量下进行高能碰撞解离（HCD）。隔离窗口设置为1.2 m/z，分辨率为17,500，AGC目标为1e5，最大IT时间为50 ms。动态排除时间设置为45秒。

MS原始数据使用Proteome Discoverer平台（版本2.4，Thermo Fisher Scientific）和Sequest HT算法处理。MS数据与包含当前L. salmonis v1.4注释、S. salar v3.1注释和UniProt Knowledgebase（UniProtKB/Swiss-Prot，审核条目；版本2025_04）的组合数据库进行搜索。允许最多有两个胰蛋白酶切割缺失。甲硫氨酸的氧化和蛋白质N端乙酰化被设置为可变修饰，半胱氨酸的甲基硫添加也是如此。MS和MS/MS的离子容忍度分别设置为10 ppm和0.02 Da。在肽和蛋白质水平上设置了最大假发现率（FDR）为1%，并且只接受识别出≥2个肽的蛋白质。

在蛋白质组学数据过滤后，使用SignalP和InterPro分析氨基酸序列数据，以识别含有信号肽的分泌蛋白，并进一步用相应的基因本体（GO）术语注释蛋白质的生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）（Blum等人，2025年；Nielsen，2025年）。“分泌蛋白”被操作性地定义为含有使用SignalP识别的预测N端信号肽的蛋白质（默认的真核生物参数）。预测含有跨膜结构的蛋白质没有被额外排除在这个分类之外。因此，这里报告的分泌亚集反映了含有典型信号肽的蛋白质，可能包括与膜相关或保留在分泌途径中的蛋白质。这种操作性定义捕捉了经典的信号肽导向的分泌，但没有区分可溶性分泌蛋白和膜整合蛋白，也没有捕捉通过非经典分泌途径或细胞外囊泡释放的蛋白质。鉴于SEP提取协议在孵育后取样了细胞外环境，预测含有信号肽的蛋白质被解释为与样本环境中的分泌相容，尽管不能排除细胞内或膜相关的贡献。

每个样本过滤后的独特蛋白质鉴定数量（此后称为蛋白质丰富度）在所有实验条件和重复实验中进行了量化。丰富度值在重复实验水平上计算（每个条件n=4），并汇总到条件水平。为了评估处理是否影响宿主体内的蛋白质丰富度，使用Welch的双样本t检验比较了银鲑鱼对照与处理过的银鲑鱼以及大西洋鲑鱼对照与处理过的大西洋鲑鱼之间的丰富度值。每个比较使用了四个生物学重复实验。鉴于重复实验水平的蛋白质组学丰富度的性质，认为满足了统计假设（独立性、近似正态性）。分别对整个蛋白质组的丰富度和仅分泌蛋白的丰富度进行了比较。显著性在α = 0.05的水平上评估。

使用BLASTp（NCBI BLAST+ v2.17.0）对22种已知唇腺蛋白质的氨基酸序列进行了序列相似性搜索，e值阈值为1e?5（?verg?rd等人，2022年；Midtb?等人，2024a年）。匹配要求在≥80%的查询长度上具有≥90%的序列同一性。因为密切相关的旁系同源物可能会产生高同一性值，因此结果被解释为高度相似的同源物，而不是确定的直系同源物。

3. 结果
3.1. L. salmonis的存活率和SEP蛋白浓度
所有评估的虱子在实验处理后存活下来，并在处理后24小时内保持存活和健康状态。
在所有16个样本中，SEP蛋白的浓度范围从328 μg/mL?1到1597 μg/mL?1，平均值为716 ± 300 μg/mL?1（表1）。
表1. 使用Nanodrop 2000分光光度计通过蛋白质A280功能测量的蛋白质浓度（单位：μg/mL）。空白校正使用了相同处理的阴性对照海水。
样本ID 蛋白质浓度（μg/mL）
大西洋鲑鱼对照 1833
大西洋鲑鱼对照 2543
大西洋鲑鱼对照 3778
大西洋鲑鱼对照 4671
大西洋鲑鱼处理过的水 1706
大西洋鲑鱼处理过的水 2667
大西洋鲑鱼处理过的水 3691
大西洋鲑鱼处理过的水 4432
银鲑鱼对照 1507
银鲑鱼对照 21597
银鲑鱼对照 3746
银鲑鱼对照 4870
银鲑鱼处理过的水 1721
银鲑鱼处理过的水 2351
银鲑鱼处理过的水 3328
银鲑鱼处理过的水 41019
宿主鲑鱼种类或其对应的对照海水来源（F?,?? = 0.46，p = 0.51）、处理（F?,?? = 1.83，p = 0.20）或它们的交互作用（F?,?? = 0.65，p = 0.44）对SEP样本的蛋白质浓度没有显著影响（双因素ANOVA，每组n = 4）。平均值（± SD）分别为S. salar对照海水处理706 ± 128 μg/mL?1，S. salar处理过的水724 ± 129 μg/mL?1，O. kisutch对照海水处理930 ± 469 μg/mL?1，O. kisutch处理过的水605 ± 330 μg/mL?1。此外，直接比较两种对照海水来源没有发现S. salar和O. kisutch处理之间的蛋白质浓度有显著差异（Welch的t检验，t = 0.98，p = 0.39）。

3.2. SEP蛋白谱型
SDS PAGE条带模式的分析显示所有SEP样本之间的蛋白质谱型有细微但可辨别的差异，尽管在处理组内存在相当大的变异（图2）。用S. salar处理过的水处理的虱子样本在约80 kDa和约17 kDa处显示出独特的条带，而用O. kisutch处理过的水处理的虱子样本（除了重复实验C3）在约70 kDa处显示出独特的条带。

3.3. SEP蛋白含量
总共在所有处理和重复实验中鉴定出254种独特的蛋白质。在处理条件水平上，检测到113–219种蛋白质（平均158.3 ± 44.3 S.D.）。通过SignalP分析信号肽的存在发现，在所有条件和重复实验中，共有148种蛋白质具有分泌性质（此后称为“分泌蛋白”，每个条件的范围为67–129种蛋白质（平均101.8 ± 25.7 S.D.）。在重复实验水平上也观察到了相似的变异性。在所有测试条件的16个重复实验中，检测到49–175种蛋白质（平均101.4 ± 38.9 S.D.），其中24–98种蛋白质（平均61.2 ± 23.3 S.D.）具有分泌性质。银鲑鱼对照重复实验产生了136 ± 41.6种蛋白质，银鲑鱼处理过的样本产生了115.8 ± 23.0种蛋白质，大西洋鲑鱼处理过的样本产生了93.5 ± 27.3种蛋白质，大西洋对照样本产生了60.3 ± 12.1种蛋白质。相应的分泌蛋白计数分别为64.0 ± 30.7、71.8 ± 10.6、69.0 ± 23.0和40.0 ± 13.0。
蛋白质丰富度在重复实验中有所不同，并在宿主物种内分别评估了处理效应。对于银鲑鱼处理过的水组和相应的对照，处理并没有显著改变整个蛋白质组的丰富度（银鲑鱼对照平均 = 87.3；银鲑鱼处理过的水平均 = 115.8；Welch的t检验 = 1.07，p = 0.338）。同样，仅分泌蛋白的丰富度也没有显著差异（银鲑鱼对照平均 = 64.0；银鲑鱼处理过的水平均 = 71.8；t检验 = 0.47，p = 0.666）。
相比之下，大西洋鲑鱼处理过的水组和相应的对照在处理过的个体中显示出比对照组更高的丰富度，无论是整个蛋白质组（大西洋鲑鱼对照平均 = 60.3；大西洋鲑鱼处理过的水平均 = 93.5）还是仅分泌蛋白的数据集（大西洋鲑鱼对照平均 = 40.0；大西洋鲑鱼处理过的水平均 = 69.0）。然而，这些差异没有达到统计显著性（整个蛋白质组：t = 2.29，p = 0.082；仅分泌蛋白：t = 2.08，p = 0.094）。
3.3. 所有条件下共享的分泌蛋白谱型
在所有16个重复实验中检测到14种不同的分泌蛋白。这些蛋白质大多是蛋白酶（即，91.67%的蛋白质具有有效的生物过程GO术语），包括丝氨酸型内肽酶和含有astacin样结构域的金属内肽酶和金属肽酶。这些蛋白酶的NCBI注释对应于低卵裂酶（共4种）、胰蛋白酶-1（共3种）、brachyurin样蛋白酶、brachyurin、胰凝乳蛋白酶原A和孵化酶1.2（每种各1种）。剩余的3种蛋白质被注释为卵黄生成素-6（与脂质转移相关）、基质金属蛋白酶-9（与II型纤维连接蛋白结构域相关）和γ-晶体蛋白1。此外，在所有四种处理条件下都检测到了64种分泌蛋白，其中分别有49、74和10个有效的GO术语用于描述生物功能、分子过程和细胞组分（图3）。这种共同的分泌蛋白谱主要由蛋白酶组成，所有具有指定功能的蛋白质中有30%参与了蛋白水解过程。这些蛋白酶包括17种丝氨酸型内肽酶、7种金属内肽酶、7种金属肽酶、3种半胱氨酸型肽酶、2种金属羧肽酶、1种丝氨酸型外肽酶和1种二肽基肽酶。除了在所有重复实验中都发现的蛋白酶外，还包括被注释为胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶家族成员2A、假定的丝氨酸蛋白酶K12H4.7、羧肽酶B、组织蛋白酶L样蛋白酶和肽酶、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶CTRL-1、胰凝乳蛋白酶BI样蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶BI的蛋白质。另有9种蛋白质被发现与锌离子结合有关，3种与肝素结合或O-糖基水解酶活性相关，2种与蛋白质结合相关，1种与细胞粘附分子结合、α-1,4-葡萄糖苷酶活性、催化活性、碱性磷酸酶活性、过氧化物酶活性（即磷脂过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶）相关、溶菌酶活性、固醇结合、酶激活活性、碳水化合物代谢（即几丁质脱乙酰酶-7）相关、β-N-乙酰葡萄糖胺酶活性或β-N-乙酰己糖胺酶活性相关。

图3. 饼图显示了在所有四种处理条件下共有的分泌蛋白集合中分配给选定基因本体（GO）术语的蛋白质比例。对于生物过程、分子功能或细胞组分这些GO术语领域，如果超过12个术语可用，则图表中包含前12个术语，其余术语则归入“其他”类别。

图4. 饼图显示了在S. salar处理的海水和对照组处理中鉴定出的分泌蛋白集合中分配给选定基因本体（GO）术语的蛋白质比例。对于生物过程、分子功能或细胞组分这些GO术语领域，如果超过12个术语可用，则图表中包含前12个术语，其余术语则归入“其他”类别。

图5. 饼图显示了在S. salar处理的海水中鉴定出的分泌蛋白集合中分配给选定基因本体（GO）术语的蛋白质比例，而在对照组处理中未检测到这些蛋白质。对于生物过程、分子功能或细胞组分这些GO术语领域，如果超过12个术语可用，则图表中包含前12个术语，其余术语则归入“其他”类别。

图6. 饼图显示了在O. kisutch处理的海水和对照组处理中鉴定出的分泌蛋白集合中分配给选定基因本体（GO）术语的蛋白质比例。对于生物过程、分子功能或细胞组分这些GO术语领域，如果超过12个术语可用，则图表中包含前12个术语，其余术语则归入“其他”类别。

在这64种分泌蛋白中，有17种的NCBI注释为“未表征蛋白”。然而，其中11种蛋白质具有有效的InterPro注释，可能有助于阐明它们的功能。例如，两种蛋白质（NCBI登录号XP_071747775.1和XP_040572125.1）被发现与Kelch型β螺旋桨结构域相关，因此可能与蛋白质结合有关；另外三种蛋白质（XP_040574440.2、XP_040569647.1、XP_040577721.1）被发现与脂质结合和运输相关，后者还与神经节苷脂分解有关。此外，XP_040566367.1与细胞粘附有关。另外两种未表征的蛋白质（XP_040579408.1和XP_040571310.1）可能与L. salmonis的免疫系统有关，前者具有C型凝集素结构域，后者与溶菌酶活性以及溶菌酶结构域和C末端杀虫剂结构域相关。最后，XP_040572657.1被注释为γ-晶体蛋白样蛋白，XP_071746852.1与肝素结合相关，并具有II型纤维连接蛋白结构域，而XP_040579422.1被注释为睡眠稳态调节因子。

在S. salar处理的水中处理的L. salmonis的SEP蛋白谱比较中，总共发现了66种在S. salar处理的水和S. salar对照组的L. salmonis SEP中都存在的蛋白质。其中50种蛋白质具有有效的GO术语，其中62%与蛋白水解相关。这些蛋白质包括17种丝氨酸型内肽酶、8种金属内肽酶、8种金属肽酶、3种半胱氨酸型肽酶、2种金属羧肽酶、1种二肽基肽酶和1种丝氨酸型外肽酶。另有10种与锌离子结合相关，7种与脂质结合相关，4种与肝素结合相关，3种具有水解酶活性，2种与蛋白质结合相关，每种还分别与碱性磷酸酶活性、α-1,4-葡萄糖苷酶活性、β-N-乙酰葡萄糖胺酶活性、β-N-乙酰己糖胺酶活性、碳水化合物结合、催化活性、细胞粘附、酶激活、溶菌酶活性、过氧化物酶活性、磷酸酶活性和固醇结合相关。相比之下，在S. salar处理的海水中处理的L. salmonis的SEP蛋白谱中独特地检测到了40种分泌蛋白，而在对照组中仅检测到1种分泌蛋白。这些“独特”的蛋白质反映了该数据集中的检测结果，应结合第3.3节中报告的非显著丰富度比较进行解释（每组n=4）。虽然对照组SEP样本中发现的这种独特蛋白质是未表征的且缺乏任何NCBI或InterPro注释，但S. salar处理的水中处理的L. salmonis的SEP蛋白谱呈现了多样化的蛋白质阵列。其中18种是蛋白酶（分别被注释为组织蛋白酶D、精液金属蛋白酶1、羧肽酶I、豆蔻蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶I、天冬氨酸蛋白酶4、xaa-Pro氨基肽酶1、羧肽酶B、孵化酶1.2、胰凝乳蛋白酶BI、锌金属蛋白酶nas-7和酚氧化酶激活因子2），还有3种蛋白酶抑制剂（凝血酶抑制剂heminin、一种未表征的 cystatin 结构域蛋白和一种papilin-1样蛋白），3种血栓调节蛋白（SCO-spondin异构体X1和A disintegrin以及具有血栓调节蛋白基序的金属蛋白酶adt-1），3种L. salmonis免疫系统蛋白（murinoglobin-1、papilin和C型凝集素BfL-1异构体X1），3种γ-晶体蛋白样蛋白，2种与几丁质和蛋白质结合相关的蛋白质（hemocytin-like），以及每种分别与肝素结合、RNA内切酶活性、碱性磷酸酶活性、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶活性和水解酶活性相关的蛋白质。此外，还有1种蛋白质被注释为含有UPAR/Ly6结构域的crok，并包含与睡眠稳态调节因子和蛇毒素超家族结构域相关的结构域。另外还检测到一种未表征的蛋白质（NCBI登录号XP_040568779.1），但缺乏进一步注释。

在O. kisutch处理的水中处理的L. salmonis的SEP蛋白谱比较中，总共发现了92种在用O. kisutch处理的海水和相应对照组海水中处理的成年雌性L. salmonis的SEP中都存在的蛋白质。虽然这种共同的分泌蛋白谱包含了一系列蛋白酶（包括22种丝氨酸型内肽酶、10种金属内肽酶、10种金属肽酶、4种金属羧肽酶、3种半胱氨酸型肽酶、1种半胱氨酸型内肽酶、1种二肽基肽酶、1种丝氨酸型外肽酶、1种金属氨基肽酶和1种肽酶），但它仍然富含具有多种分子功能的蛋白质。这些蛋白质包括14种与锌离子结合相关的蛋白质、8种与脂质转运相关（主要是卵黄生成素）、4种与肝素结合或蛋白质结合相关、3种具有水解酶活性、2种与几丁质结合、酶激活、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性或过氧化物酶活性相关，以及1种与ATP结合、ATP水解、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶活性、碱性磷酸酶活性、α-1,4-葡萄糖苷酶活性、β-N-乙酰葡萄糖胺酶活性、β-N-乙酰己糖胺酶活性、碳水化合物结合、催化活性、细胞粘附分子结合、内肽酶抑制剂活性、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶活性、血红素结合、溶菌酶活性、磷酸酶活性、磷酸二酯水解酶活性和固醇结合相关。此外，在用O. kisutch处理的海水中处理的个体的SEP中独特地检测到了37种分泌蛋白，而在相应的对照组SEP样本中检测到了14种分泌蛋白。对照组L. salmonis SEP中独特的蛋白质包括4种不同的蛋白酶（分别用NCBI描述为胰蛋白酶、胰蛋白酶-1、天冬氨酸蛋白酶4和组织蛋白酶D）、2种水解酶、一种C型凝集素样蛋白、一种γ-晶体蛋白样蛋白、一种含有serpin结构域的蛋白酶抑制剂、一种假定的抗坏血酸过氧化物酶、一种含有FAS-1结构域的蛋白、一种含有II型纤维连接蛋白结构域的蛋白和一种saposin样蛋白。相比之下，用O. kisutch处理的海水中处理的L. salmonis的SEP蛋白谱与更丰富的蛋白质功能多样性相关。这些蛋白质包括8种蛋白酶（丝氨酸蛋白酶48异构体X1和X2、含有CLIP结构域的丝氨酸蛋白酶HP8、孵化酶1.2、毒液丝氨酸蛋白酶Bi-VSP、羧肽酶B和胰凝乳蛋白酶原A）、4种蛋白酶抑制剂（inter-alpha-trypsin抑制剂重链H3样和含有cystatin、serpin和Kunitz结构域的未表征蛋白）、3种血栓调节蛋白（SCO-spondin异构体X1和A disintegrin以及具有血栓调节蛋白基序的金属蛋白酶adt-1）、3种γ-晶体蛋白样蛋白、2种与几丁质和蛋白质结合相关的蛋白质（hemocytin-like），以及每种分别与肝素结合、RNA内切酶活性、碱性磷酸酶活性、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶活性和溶菌酶活性相关的蛋白质。此外，还检测到1种含有UPAR/Ly6结构域的蛋白质crok，并包含与睡眠稳态调节因子和蛇毒素超家族结构域相关的结构域。另外还检测到一种未表征的蛋白质（NCBI登录号XP_040568779.1），但缺乏进一步注释。

在用O. kisutch处理的水中处理的L. salmonis的SEP蛋白谱比较中，总共发现了92种在用O. kisutch处理的海水和相应对照组海水中处理的成年雌性L. salmonis的SEP中都存在的蛋白质。尽管这种共同的分泌蛋白谱包含了一系列蛋白酶，但它仍然富含具有多种分子功能的蛋白质。这些蛋白质包括14种与锌离子结合相关的蛋白质、8种与脂质转运相关（主要是卵黄生成素）、4种与肝素结合或蛋白质结合相关、3种具有水解酶活性、2种与几丁质结合、酶激活、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性或过氧化物酶活性相关，以及1种与ATP结合、ATP水解、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶活性、碱性磷酸酶活性、α-1,4-葡萄糖苷酶活性、β-N-乙酰葡萄糖胺酶活性、β-N-乙酰己糖胺酶活性、碳水化合物结合、催化活性、细胞粘附分子结合、内肽酶抑制剂活性、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶活性、血红素结合、溶菌酶活性、磷酸二酯水解酶活性和固醇结合相关。此外，在用O. kisutch处理的海水中处理的个体的SEP中独特地检测到了37种分泌蛋白，而在相应的对照组SEP样本中检测到了14种分泌蛋白。对照组L. salmonis SEP中独特的蛋白质包括4种不同的蛋白酶（分别用NCBI描述为胰蛋白酶、胰蛋白酶-1、天冬氨酸蛋白酶4和组织蛋白酶D）、2种水解酶、一种C型凝集素样蛋白、一种γ-晶体蛋白样蛋白、一种含有serpin结构域的蛋白酶抑制剂、一种假定的抗坏血酸过氧化物酶、一种含有FAS-1结构域的蛋白、一种含有II型纤维连接蛋白结构域的蛋白和一种saposin样蛋白。相比之下，用O. kisutch处理的海水中处理的L. salmonis的SEP蛋白谱与更丰富的蛋白质功能多样性相关。这些蛋白质包括8种蛋白酶（丝氨酸蛋白酶48异构体X1和X2、含有CLIP结构域的丝氨酸蛋白酶HP8、孵化酶1.2、毒液丝氨酸蛋白酶Bi-VSP、羧肽酶B和胰凝乳蛋白酶原A）、4种蛋白酶抑制剂（inter-alpha-trypsin抑制剂重链H3样和含有cystatin、serpin和Kunitz结构域的未表征蛋白）、2种含有纤维连接蛋白结构域的蛋白（II型和III型）、2种γ-晶体蛋白样蛋白、2种具有上皮生长因子结构域的蛋白、1种含有热休克蛋白90结构域的蛋白、1种神经递质门控离子通道、1种硫氧还蛋白、1种内切酶、1种含有E1A刺激基因抑制结构域的蛋白、1种碱性磷酸酶、1种含有睡眠稳态调节因子和蛇毒素超家族结构域的蛋白以及1种calycin。

在这项实验观察到的分泌蛋白谱中检测到了两种不同的唇腺蛋白序列。蛋白质XP_040574063.2和XP_040574064.2（两者都具有NCBI注释“未表征蛋白”）分别与LslGP3的氨基酸序列有94.36%和94.87%的序列同一性。这两种蛋白质在所有四种处理条件下都被检测到。XP_040571157.1（NCBI注释为胰凝乳蛋白酶原A）仅在O. kisutch处理的海水处理组中被检测到，并且与LslGSP1.4的氨基酸序列有97%的序列同一性。

分析分泌和排泄产物（SEPs）提供了L. salmonis在宿主-寄生虫界面产生的广泛蛋白质的功能相关快照，捕捉到了寄生虫衍生物在其天然分泌形式中的多样性。在这方面，本研究探索的新技术从单个成年雌性L. salmonis中提取SEPs，产生了稳健的定性蛋白质组数据，同时捕捉到了在采用混合提取方法的研究中掩盖的个体分泌动态的多样性，并减少了粪便污染。SEP样本中的蛋白质浓度与之前使用已表征的混合提取技术研究观察到的浓度相当，这里报告的范围为328–1597 μg/mL?1，与Hamilton等人（2018年）和Dindial等人（2025年）报告的值100–1900 μg/mL?1和125–1189 μg/mL?1非常接近。值得注意的是，本研究中鉴定出的L. salmonis蛋白质的数量（254种）明显多于Hamilton等人（2018年）和Dindial等人（2025年）报告的成年虱子的数量（分别为187种和117种，前者还包括在预成虫阶段检测到的蛋白质）。虽然本研究中16个重复实验中检测到的蛋白质范围（每个重复实验49–175种蛋白质，平均101.4 ± 38.9 SD）表明所研究的个体SEP样本具有广泛的变异性，但这种程度的变异性与其他个体外寄生虫的分泌组和唾液组研究观察到的变异性一致。这一点在早期对蜱虫的研究中得到了强调，这些研究表明即使在相似条件下，蜱虫的唾液腺蛋白谱也存在明显的分子个体性，并且由于进食状态的差异而进一步加剧（Wang等人，2001年；Kim等人，2016年）。此外，对个体的转录组分析证实，同一物种和生命阶段的蜱虫的唾液腺表达谱可以有很大差异，这种模式在混合样本研究中常常被掩盖（Perner等人，2018年）。本研究中观察到的分泌蛋白谱揭示了一系列潜在的毒力因子。首先，鉴定出了两种唇腺蛋白LslGP3和LslGSP1，前者在所有测试条件下都被检测到，后者仅在用银鲑处理的海水中处理的组中被检测到（Midtb?等人，2024a）。LslGP3已知能与鲑鱼白细胞上的一种尚未确定的表面受体结合，从而引发下游的细胞凋亡，而LslGSP1则是一种丝氨酸蛋白酶，据认为它可以抑制宿主的免疫反应，因为其敲低表达会导致L. salmonis附着部位细胞因子转录本的增加（Midtb?等人，2024b；Midtb?等人，2024a）。本研究中在单个成年雌性个体中持续检测到这两种蛋白质，进一步证实了它们是L. salmonis毒力库的核心组成部分。除了这些已被广泛研究的唇腺因子外，本研究还调查了个体水平的SEP样本，其中包含多种蛋白酶和蛋白酶抑制剂。虽然这些功能类别的蛋白质之前已在L. salmonis的SEP中被观察到，但本研究提供了它们在个体间存在差异的直接证据（Hamilton等人，2018；Dindial等人，2025）。分泌蛋白酶被广泛认为是蜱虫和螨虫等外寄生虫的关键毒力因子，它们有助于组织穿透、营养获取和免疫调节。例如，亚洲蓝蜱Rhipicephalus microplus的半胱氨酸蛋白酶BmCL1通过诱导纤维蛋白原水解来抑制凝血，而疥螨Sarcoptes scabies的丝氨酸蛋白酶Sar s 3则切割人类皮肤蛋白丝聚蛋白以促进消化（Beckham等人，2009；Xavier等人，2019；Fernando和Fischer，2020）。此外，在免疫调节方面，猫蚤Ctenocephalides felis的丝氨酸蛋白酶CfSP28能够切割宿主免疫球蛋白G，而S. scabies的丝氨酸蛋白酶类似物SMIPP-Ss则通过结合甘露糖结合凝集素、properdin和C1q来调节宿主免疫（Silver等人，2002；Reynolds等人，2014；Fernando和Fischer，2020）。这里检测到的多种胰蛋白酶、金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等表明L. salmonis可能采用了一种策略来应对宿主的屏障和炎症反应。此外，本研究还发现了多种蛋白酶抑制剂，包括丝氨酸蛋白酶抑制剂和Kunitz型抑制剂，它们的存在表明存在额外的调控层。这些分子可能保护寄生虫组织免于自消化，同时调节与凝血、白细胞增殖和细胞因子产生相关的宿主蛋白酶级联反应（Chmela?等人，2017；Jmel等人，2023；Dindial等人，2025）。例如，Ixodes ricinus的丝氨酸蛋白酶Iris可以结合巨噬细胞以抑制肿瘤坏死因子的分泌，抑制T细胞增殖，并干扰脊椎动物宿主的止血过程；而Rhipicephalus microplus的Kunitz型抑制剂boophilin可以结合凝血酶，直接阻碍哺乳动物宿主的正常止血过程（Prevot等人，2006；Corral-Rodríguez等人，2009；Prevot等人，2007）。尽管鱼类外寄生虫的SEP蛋白质组研究有限，难以进行跨分类群的比较，但迄今为止唯一一项关于Argulus foliaceus的SEP蛋白质组研究也报告了分泌/排泄的蛋白酶、金属蛋白酶（包括astacins）和蛋白酶抑制剂（包括丝氨酸蛋白酶抑制剂），以及一些具有预测信号肽的蛋白质（AmbuAli等人，2020）。这种在不同甲壳类外寄生虫中的共性支持了蛋白水解和免疫调节相关蛋白家族是外寄生虫分泌库中反复出现的成分的观点，但仍需在L. salmonis中进行功能验证。除了蛋白酶和蛋白酶抑制剂外，本研究还发现了几种与氧化应激相关的酶，包括过氧化物酶（Hamilton等人，2018；Dindial等人，2025）。尽管它们在L. salmonis中的功能尚未完全明了，但在其他吸血外寄生虫中，过氧化物酶在解毒由炎症引起的活性氧方面起着核心作用，从而减轻寄生虫体内的氧化应激（Paw?owska等人，2023）。例如，已在羊螨Psoroptes ovis的咽部观察到过氧化物还原酶的存在，而鹿蜱Ixodes scapularis已知会分泌过氧化物还原酶和超氧化物歧化酶（McNair等人，2009；Das等人，2001）。因此，在银鲑鱼上，已观察到宿主谷胱甘肽过氧化物酶1b和金属硫蛋白在桡足类附着部位的上调，这可能有助于保护宿主组织免受感染产生的活性氧的损害，强调了分泌因子在减轻L. salmonis氧化应激中的潜在重要性（Sveen等人，2025）。本研究检测到多种纤维连接蛋白II结构域金属蛋白酶（如基质金属蛋白酶-9，在所有条件下均有发现），这突显了L. salmonis分泌蛋白的多功能性。虽然已知这些蛋白质由L. salmonis的表皮腺分泌，并被认为在减轻表皮污染方面发挥作用，但对银鲑鱼桡足类附着部位的空间转录组研究表明，银鲑鱼金属蛋白酶抑制因子2样蛋白的表达增加，这可能表明L. salmonis金属蛋白酶在银鲑鱼对感染的反应中也起作用（?verg?rd等人，2016；Harasimczuk等人，2018；Sveen等人，2025）。这些数据还揭示了L. salmonis中一些尚未完全表征的潜在毒力因子。例如，本研究鉴定出的一种分泌蛋白XP_040579469.1（NCBI注释为含有UPAR/Ly6结构域的crok），在所有条件下均有检测到，除了S. salar对照组。InterPro将其注释为“睡眠稳态调节剂，蛇毒素超家族”和“含有UPAR/Ly6结构域的Quiver样蛋白”。这种LY6/uPAR样蛋白根据结构预测具有特征性的三指折叠，由多个二硫键支撑，其结构与调节烟碱乙酰胆碱受体、免疫细胞激活和上皮屏障信号的哺乳动物LY6家族神经调节剂及毒液来源的α-神经毒素相似（Vasilyeva等人，2017）。尽管这类蛋白质在外寄生虫中大多尚未被表征，但它们在其他系统中的神经和免疫调节作用使其成为未来研究L. salmonis毒力的有趣候选对象。本研究还发现了多种氧化应激相关酶，包括过氧化物酶（Hamilton等人，2018；Dindial等人，2025）。尽管它们在L. salmonis中的功能尚未完全明了，但在其他吸血外寄生虫中，过氧化物酶在解毒炎症引起的活性氧方面起着关键作用（Paw?owska等人，2023）。例如，已在羊螨Psoroptes ovis的咽部观察到过氧化物还原酶的存在，而鹿蜱Ixodes scapularis已知会分泌过氧化物还原酶和超氧化物歧化酶（McNair等人，2009；Das等人，2001）。因此，在银鲑鱼上观察到桡足类附着部位宿主谷胱甘肽过氧化物酶1b和金属硫蛋白的上调，这可能有助于保护宿主组织免受感染产生的活性氧的损害（Sveen等人，2025）。检测到多种纤维连接蛋白II结构域金属蛋白酶（如基质金属蛋白酶-9，在所有条件下均有发现）进一步强调了L. salmonis分泌蛋白的多功能性。虽然已知这些蛋白质由L. salmonis的表皮腺分泌，并被认为在减轻表皮污染方面发挥作用，但对银鲑鱼桡足类附着部位的空间转录组研究表明，银鲑鱼金属蛋白酶抑制因子2样蛋白的表达增加，这可能表明L. salmonis金属蛋白酶在银鲑鱼对感染的反应中也起作用（?verg?rd等人，2016；Harasimczuk等人，2018；Sveen等人，2025）。这些数据还提供了关于L. salmonis潜在毒力因子的见解。例如，本研究鉴定出的一种分泌蛋白XP_040579469.1（NCBI注释为含有UPAR/Ly6结构域的crok），在所有条件下均有检测到，除了S. salar对照组。InterPro将其注释为“睡眠稳态调节剂，蛇毒素超家族”和“含有UPAR/Ly6结构域的Quiver样蛋白”。这种LY6/uPAR样蛋白根据结构预测具有特征性的三指折叠，由多个二硫键支撑，其结构与调节烟碱乙酰胆碱受体、免疫细胞激活和上皮屏障信号的哺乳动物LY6家族神经调节剂及毒液来源的α-神经毒素相似（Vasilyeva等人，2017）。尽管这类蛋白质在外寄生虫中大多尚未被表征，但它们在其他系统中的神经和免疫调节作用使其成为未来研究L. salmonis毒力的有趣候选对象。本研究收集的数据还显示，在所有处理条件下均存在一种几丁质脱乙酰酶-7（CDA7；NCBI访问号XP_040580790.1）。几丁质脱乙酰酶将几丁质转化为几丁聚糖，这是一种免疫原性较低的聚合物，可能限制宿主模式识别受体的结合和几丁质酶介导的炎症途径的激活（Liu等人，2019）。此外，已证实易受L. salmonis感染的S. salar表现出酸性哺乳动物几丁质酶的表达下调，而O. kisutch对L. salmonis几丁质表现出强烈的巨噬细胞驱动反应（Braden等人，2023；Usmasuthan等人，2020）。这种CDA7可能用于掩盖暴露的角质几丁质或在几丁质片段与宿主凝集素和上皮模式识别受体结合之前对其进行脱乙酰化，从而可能有助于该物种的几丁质感知避让策略。尽管在鲑鱼条件海水处理条件下的虱子SEP与其对照组之间未发现蛋白质丰富度的统计学显著差异，但条件海水处理SEP的分泌蛋白谱仍包含更多具有多种功能的蛋白质。这在S. salar条件海水处理条件下最为明显，其检测到40种独特的分泌蛋白，而对照组仅检测到1种。其中包括多种潜在的毒力因子，如Kunitz型和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。相应地，O. kisutch条件水处理条件下的分泌蛋白数量约为对照组的2.6倍，同时也含有更多的蛋白酶（如LslGSP1、胰凝乳蛋白酶样肽酶和astacin样金属蛋白酶）和蛋白酶抑制剂（如Kunitz型和丝氨酸蛋白酶抑制剂）。然而，需要注意的是，由于本研究中的鲑鱼条件海水样本收集条件不同，因此无法直接比较这两种鲑鱼处理的效果。未来需要采用更受控制的条件来进行更彻底的比较。此外，需要注意的是，本研究中检测到的一些蛋白质（如卵黄生成素）可能是真正释放到分泌环境中的；然而，它们也可能来自血淋巴泄漏或在液滴孵育/收集过程中的机械应力。这些蛋白质组数据本身无法区分这些可能性。虽然本研究检查的所有个体均为成年雌性，但L. salmonis的分泌蛋白谱可能受性别和生殖状态的影响。转录组分析显示了明显的性别偏向基因表达，包括雄性中Kunitz结构域蛋白酶抑制因子的差异表达和扩增，以及涉及宿主-寄生虫相互作用的基因的性别特异性进化轨迹（Poley等人，2016；Michaud，2025）。这些发现表明雄性虱子可能采用不同的分泌策略，可能反映了摄食行为、交配生物学或免疫调节需求的差异。在成年雌性虱子中，交配前后的状态转变或与产卵相关的变化可能会驱动分泌成分的变化，因为能量资源重新分配到繁殖上。进一步应用此处开发的SEP提取方法为研究L. salmonis分泌组中的性别和生殖相关动态提供了方法学框架。尽管个体间存在显著差异，但在所有条件下均一致检测到64种分泌蛋白，包括丰富的蛋白酶和CDA7等蛋白质。这些蛋白质的重复检测频率总结在表S1中。鉴于本研究和其他外寄生虫研究中观察到的个体虱子SEP蛋白谱的差异，这些核心分泌蛋白的一致性可能需要进一步研究和表征，以更好地阐明L. salmonis中宿主-寄生虫相互作用的动态，而该方法学可能为未来高通量分析处理对L. salmonis分泌组的影响提供基础。5. 结论本研究提出了一种新的SEP收集方法，可以从个体中分离出未受污染的SEP，从而估计样本群体内SEP产生的变异性。本研究揭示了一系列潜在的毒力因子，并阐明了新的可能与毒力相关的蛋白质，同时捕捉到了不同鲑鱼条件水处理下个体虱子分泌组的大范围变异。这种个体水平的SEP分泌蛋白谱变异对于进一步研究针对SEP蛋白的靶向疗法和疫苗非常重要。然而，这类治疗开发工作需要使用原位杂交、基因敲除和转录组学等技术对所描述的SEP蛋白进行功能表征，以更好地确定这些蛋白的作用。