基于结构指导的中和表位发现方法，使得针对SVCV（猪圆环病毒）的多表位纳米颗粒疫苗能够实现理性设计

《Fisheries Research》：Structure-guided discovery of neutralizing epitopes enables rational design of a multi-epitope nanoparticle vaccine against SVCV

结构导向策略用于识别SVCV G蛋白中和抗体表位，并通过自组装铁蛋白多表位纳米颗粒疫苗显著提升鱼类免疫保护效果，为水生动物精准疫苗设计提供新框架。

　　

李玉雅|赵亮|魏雪峰|任晓航|夏俊尧|赵赵|朱斌

西北农林科技大学动物科学技术学院，中国杨陵712100

摘要

鲤鱼病毒（SVCV）的春季病毒血症对鲤鱼养殖业造成了重大的经济负担，而针对这种病原体的精准疫苗仍然有限。本文提出了一种基于中和抗体与SVCV糖蛋白（G）相互作用界面的结构引导表位发现策略。通过蛋白质对接和丙氨酸扫描能量分析，鉴定了G蛋白上的三个保守的抗体靶标表位，并通过表位特异性抗体耗竭实验和免疫实验进一步验证了它们的免疫相关性。为了增强表位的免疫原性和抗原呈递能力，将选定的表位串联起来并展示在斑马鱼铁蛋白上，生成了一种自组装的多表位纳米疫苗。免疫实验表明，与表位串联组（CP）或铁蛋白组（CF）相比，多表位疫苗（MEV）诱导了更强的IgM反应，并提供了更强的SVCV挑战保护作用，相对存活率为43.48%，目标组织中的病毒载量显著降低。组织病理学分析进一步证实关键免疫器官的组织损伤减少。总体而言，这一结果建立了一个基于结构、以抗体信息为导向的表位鉴定和多表位疫苗设计框架，为水生物种病毒性疾病的精准疫苗设计提供了概念性框架。

引言

鲤鱼病毒（SVCV）的春季病毒血症是一种高致病性病毒，对全球淡水养殖业构成了严重威胁，尤其是对鲤科鱼类的生产[1]。作为世界动物卫生组织（WOAH）列出的需报告疾病，SVCV感染通常与全身出血和高死亡率相关，导致中国、欧洲和其他地区的水产养殖业遭受重大经济损失[2]。尽管已经广泛探索了灭活疫苗和减毒活疫苗，但由于生物安全问题、高生产成本以及保护性免疫持续时间较短，这些疫苗在水生物种中的应用仍然有限[3]。因此，迫切需要开发安全、有效且精准靶向的SVCV亚单位疫苗。

疫苗开发的核心目标是识别能够引发强效中和抗体反应的抗原决定簇。与非中和抗体不同，中和抗体在感染早期通过干扰病毒生命周期的关键步骤（包括受体结合、膜融合和病毒进入）来发挥作用，从而有效限制病毒传播[4]，[5]。SARS-CoV-2大流行的证据进一步强调了中和抗体表位在治疗性抗体和高效疫苗开发中的关键作用[6]，[7]。SVCV糖蛋白（G）作为主要的表面抗原，负责宿主细胞附着和膜融合，是诱导保护性免疫反应的主要靶点，因此成为疫苗设计的主要焦点[8]。然而，传统的表位映射策略（如重叠肽库或随机扫描方法）依赖于广泛的实验筛选，可能无法系统地捕捉功能表位的空间和构象特征[9]。结构和计算生物学的最新进展使得基于结构的建模和表位预测工具（如AlphaFold和IEDB）成为更合理和高效的疫苗开发方法[10]，[11]，[12]。在这个框架下，利用功能性中和抗体的反向疫苗学策略可以在三维水平上识别关键抗原残基，为基于表位的疫苗设计提供了新的机会[13]。

由于单表位的分子量小、结构简单以及在体内易快速降解，它们往往无法在鱼类中诱导持久而强烈的免疫反应，这限制了它们作为独立疫苗抗原的有效性[14]。此外，依赖单一表位通常会导致免疫焦点狭窄，可能不足以覆盖病毒进入和感染所涉及的多个功能区域[15]。为了解决这些限制，多表位免疫已成为一种有前景的疫苗设计策略。通过在一个单一免疫原中结合多个功能相关的抗原决定簇，这种方法旨在扩大诱导的免疫反应范围并提高对病毒遗传多样性的抵抗力。此外，合理选择和组装保守的、免疫优势表位可以实现更精确的免疫靶向，从而减少脱靶反应，并最小化具有潜在免疫病理学或促炎效应的序列的整合[16]。然而，简单的表位串联并不一定能确保强免疫原性，因为抗原的空间组织和呈递是免疫激活的关键决定因素。基于纳米粒子的递送系统为抗原稳定和控制空间展示提供了多功能平台。铁蛋白是一种天然存在的蛋白质，具有内在的自组装能力，能够形成高度对称的笼状纳米结构。其外表面能够重复且有序地展示异源抗原，从而模拟病毒表面的有序拓扑结构，促进B细胞受体的有效交联[17]。因此，基于铁蛋白的纳米支架已被广泛用于针对多种病毒病原体的疫苗开发。

尽管纳米技术在人类疫苗开发中取得了显著成功，但其在鱼类抗病毒免疫中的合理设计和机制应用仍然相对较少。为了解决这一差距，我们开发了一种基于结构的策略来精确识别SVCV G蛋白上的功能相关表位。在本研究中，使用了一种中和单链抗体作为分子探针，并结合蛋白质对接和丙氨酸扫描能量分析来预测和优先考虑候选抗体靶标表位。随后在体内评估了单个表位的免疫原性。基于这些发现，将多个表位进一步组装到一个单一免疫原中，并展示在基于铁蛋白的纳米支架上，构建了一个多价抗原呈递系统。通过整合体液免疫反应、免疫基因表达谱以及对抗SVCV挑战的保护效果的分析，我们在斑马鱼的概念验证模型中展示了基于结构引导的多表位整合作为合理疫苗设计策略的潜力。总体而言，这项工作为基于抗体的表位鉴定和纳米平台支持的抗原呈递建立了一个概念性框架，为鱼类病毒性疾病的精准疫苗开发提供了可行的策略。

章节片段

动物、病毒和质粒

斑马鱼（Danio rerio）从中国上海的一家商业供应商处获得，并在标准实验室条件下（200厘米×50厘米×60厘米的循环水培系统中）进行饲养。本研究中使用的SVCV菌株是实验室保存的分离株（GenBank登录号：MW020576.1）。表达载体pET-N-GST-PreScission也是从实验室库存中获得的。

SVCV G3结构域与S6的对接

SVCV G蛋白的G3结构域是一个免疫优势抗原区域，

抗原-抗体界面的结构分析

使用RoseTTAFold2和ClusPro 2.0对G3结构域和S6抗体之间的结构建模和相互作用进行了预测。结构建模表明，S6可能与G3结构域上的多个空间分布的表面区域相互作用（图1A）。这些相互作用主要由VH结构域的框架区域（FRs）介导，VL结构域的FR4区域也贡献了一个额外的相互作用位点。对结合界面的详细分析

讨论

随着水产养殖业的迅速扩张，越来越多的努力被投入到水生物种传染病的预防和控制中。然而，大多数鱼类病毒性疾病的疫苗开发仍然主要依赖于经验性方法，包括灭活疫苗或减毒活疫苗、DNA疫苗以及基于全长病毒结构蛋白的制剂[19]，[20]。尽管这些传统策略可以提供一定程度的保护，

结论

在本研究中，我们采用了一种基于结构的反向疫苗学策略来识别SVCV G蛋白上的抗体靶标表位，并开发了一种基于铁蛋白的多表位纳米疫苗。通过将计算预测与实验验证相结合，我们首先证明了所选表位能够被SVCV特异性抗体优先识别，并能在斑马鱼中诱导体液免疫反应。当这些表位展示在铁蛋白支架上时，

作者声明

概念构思：李玉雅、朱斌；数据整理：李玉雅、赵亮、魏雪峰；形式分析：李玉雅、赵赵、任晓航、夏俊尧；研究调查：朱斌；方法学：李玉雅、朱斌；初稿撰写：李玉雅；审稿和编辑：魏雪峰、赵亮、赵赵。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

伦理批准和参与同意

所有活动均遵循西北农林科技大学《动物护理和使用指南》中的规定进行。动物使用方案已由中国西北农林科技大学动物伦理与福利委员会审查并批准（批准编号：DK2025204）。

数据可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32173011）的支持。