综述：推进Marchantia polymorpha的功能基因组学研究：诱导突变技术工具包及其应用综述

《Plant Molecular Biology Reporter》：Advancing Functional Genomics in Marchantia polymorpha: A Review of Induced Mutagenesis Toolkits and Applications

　　摘要：苔类植物Marchantia polymorpha已成为研究植物进化、发育和生理学的首选模型系统。其系统发育位置、单倍体优势的生活周期以及紧凑的基因组为遗传分析和功能基因组学研究提供了独特的优势。本文综述并评估了为Marchantia polymorpha开发和优化的各种诱导突变方法。我们讨论了经典的随机突变技术，如化学（例如EMS、亚硝酸钠）和物理（例如紫外线、伽马射线和重离子束）处理方法，以及可编程核酸酶系统（包括CRISPR/Cas9和TALENs）的变革性影响。高效转化和传递平台（尤其是农杆菌介导和生物弹射方法）的日益普及，加速了这种基础陆生植物的反向遗传学和精确编辑的进展。通过比较这些方法的机制、效率和应用，我们强调了诱导突变如何促进了Marchantia polymorpha中功能基因组学的快速发展。最后，我们概述了新兴的前沿技术，如碱基编辑和prime编辑、增强的同源定向修复以及合成调控回路，这些技术有望进一步提高该模型在进化生物学和应用植物生物技术中的实用性。

引言：植物生命向陆地迁移是地球历史上的一个关键事件，苔藓植物（包括Marchantia）是最早登陆陆地的植物的现存亲属。Marchantia属属于Marchantiophyta门，是这些早期分化陆生植物的关键代表，为我们提供了了解促进陆地生存的进化创新的独特窗口（Qiu等人，2006年；Wickett等人，2014年）。在苔类植物中，Marchantia polymorpha因其简单的叶状体形态、占优势且易于操作的单倍体配子体世代以及适合遗传研究的短生命周期而成为首选的模式生物（Bowman等人，2017年；Kohchi等人，2021年）。由于其单倍体优势的生活周期、简单的身体结构以及支持正向和反向遗传学研究的多种分子遗传工具，Marchantia polymorpha已成为研究植物发育和进化的强大模型系统（Ishizaki等人，2016年）。Marchantia polymorpha的价值深深植根于其基因组的简单性。它的单倍体特性意味着突变不会被等位基因冗余所掩盖，从而实现了基因型与表型之间的直接联系，非常适合正向遗传学研究。其测序基因组大小约为225 Mb，相对较小且遗传冗余度较低，但仍保留了一组控制发育、应激反应和代谢的核心基因，使其成为功能注释的理想系统（Bowman等人，2017年）。

模型系统的有效性取决于可用于操作的遗传工具。诱导突变技术的发展将Marchantia polymorpha从一个生物学研究对象转变为功能基因组学的重要工具。本文概述了目前可用于Marchantia polymorpha的突变工具包。我们探讨了经典随机突变方法的应用、靶向基因组编辑技术带来的革命，以及实现这些技术的传递系统。我们的目标是综合这些方法如何用于解码基因功能、阐明进化途径，并利用这一新兴模型系统进行基础和应用研究。这些进展共同建立了一个强大的流程，将Marchantia polymorpha的基因型与表型联系起来，包括随机和靶向突变、高通量筛选以及分子表征（图1）。

图1：Marchantia polymorpha中基因发现的功能基因组学流程。随机或靶向突变从野生型植物中产生遗传变异，形成突变群体。这些群体经过高通量表型筛选，以识别具有感兴趣性状的个体。随后通过遗传图谱分析和测序方法分析候选突变体，以确定致病突变。最后，利用多组学方法（包括转录组学、代谢组学和蛋白质组学）进行功能表征，从而阐明基因功能和潜在的生物学机制。

经典随机突变方法：随机突变仍然是产生遗传多样性和识别参与生物过程的新基因的基础方法。这些方法包括化学和物理因素，可以在不需要预先了解序列的情况下在整个基因组中诱导突变，使其非常适合正向遗传学筛选。

化学突变：化学诱变剂（如乙基甲磺酸酯、EMS）和碱基类似物以及插入剂主要通过导致DNA复制过程中的错配来诱导点突变。最常用的EMS通过烷基化鸟嘌呤碱基，导致G/C转变为A/T（Till等人，2007年）。其有效性已在被子植物中得到验证，产生了具有除草剂耐受性和抗病性的突变群体。例如，通过突变乙酰羟酸合成酶（AHAS）（imidazolinone除草剂的目标酶），开发出了耐imidazolinone的玉米品系，从而具有抗除草剂活性的AHAS（Newhouse等人，1991年）和抗枯萎病的突变体SA0169（Lo等人，2022年）。尽管化学突变在Marchantia polymorpha中的应用仍处于初级阶段，但它带来了独特的挑战和机遇。单倍体配子体是占优势的世代，这意味着突变会立即受到选择压力。这是一把双刃剑：虽然它简化了隐性突变的识别，但也增加了致死的可能性，因此需要仔细调整突变剂量以在突变密度和生存能力之间取得平衡。处理孢子的EMS方案需要系统优化；确定参数（如LC??值，如Tagetes物种所做的一样（Lenawaty等人，2022年）是关键的第一步。然而，其潜力是巨大的。Marchantia中的EMS诱导突变库可以成为无偏筛选发育缺陷、应激耐受性或代谢性状的强大资源，补充后续讨论的靶向方法。

物理突变和重离子束：物理诱变剂，包括紫外线（UV）和伽马辐射，通过诸如嘧啶二聚体形成（UV）或自由基生成引起的DNA链断裂（伽马射线）等机制诱导遗传变化（Ali等人，2015年；Gupta等人，2019年）。这些方法已广泛应用于作物改良和功能基因组学。在Marchantia polymorpha中，UV辐射既作为非生物胁迫因子研究适应性反应（包括受叶状体发育阶段影响的紫外线吸收酚类化合物的积累（Soriano等人，2021年），也作为诱变剂生成大量突变群体以进行正向遗传学筛选，以鉴定根状体发育的调控因子（Champion等人，2021年）。一种特别有效的物理突变方法是重离子束辐照，它利用碳离子等粒子。由于重离子具有高线性能量转移（LET），它们会导致密集的离子化轨迹，从而造成复杂的、通常是不可修复的DNA损伤，包括双链断裂和大片段缺失（Kazama等人，2011年）。与低LET辐射（如伽马射线）相比，这导致了更高的突变频率和更广泛的突变谱。

重离子突变在Marchantia中的有效性已得到充分证明。Sakai等人（2019年）对孢子进行了辐照，仅从9000个筛选个体中分离出了19个形态突变体，这一高回收率突显了其在大规模正向遗传学筛选中的有效性。这里的关键优势是能够生成高密度的失功能突变，有助于快速识别控制可见表型（如配子体形态）的基因。这使得重离子束成为旨在饱和基因组突变以揭示所有参与特定过程的遗传位点的随机突变活动的理想选择。

靶向基因组工程技术：可编程核酸酶的出现通过实现精确的靶向基因组修饰彻底改变了遗传学。这些技术已在Marchantia polymorpha中迅速得到应用，将研究范式从随机突变转变为反向遗传学。

CRISPR/Cas9及其衍生编辑器：来自化脓链球菌的CRISPR/Cas9系统已成为靶向基因组编辑的首选工具。其简单性依赖于引导RNA（gRNA）来定位目标，并利用Cas9核酸酶创建双链断裂（DSB），通过易出错的非同源末端连接（NHEJ）修复途径在Marchantia中实现了高效的基因敲除（Sugano等人，2014年，见图2）。Marchantia的单倍体优势生活周期使得编辑后的突变可以直接在配子体世代中表达，从而快速识别突变表型并实现高效的基因型-表型关联（Sugano等人，2018年）。使用在MpU6启动子下表达引导RNA和在MpEF1α启动子下表达Cas9的载体，实现了高编辑效率，而经过密码子优化的Cas9进一步提高了突变效率（Sugano等人，2018年）。CRISPR组分的传递通常通过农杆菌介导的孢子或再生组织转化来实现，从而高效地回收和繁殖编辑后的品系（Kuluev等人，2019年；Sandhya等人，2020年；Wu等人，2024年）。此外，同时表达两个引导RNA可以生成从约1 kb到超过10 kb的大片段基因组缺失，展示了该系统在Marchantia中进行靶向基因组操作的多功能性（Sugano等人，2018年）。多重基因组编辑策略进一步实现了多个位点的同时靶向，扩展了基因家族和调控网络的功能分析潜力。这种方法已成功用于解析多种过程，从生殖发育（Tsuzuki等人，2019年）到核结构（Wang等人，2021年）。

图2：Marchantia polymorpha中的CRISPR/Cas9基因组编辑工作流程。引导RNA被设计用于靶向特定的基因组位点，并克隆到在MpU6启动子下表达单个引导RNA（sgRNA）和在MpEF1α启动子下表达Cas9的载体中。这些构建体被引入农杆菌肿瘤菌中，并通过农杆菌介导的转化传递到Marchantia孢子或再生组织中。在植物细胞中，sgRNA引导Cas9定位到目标DNA序列附近的原间隔序列（PAM）处，Cas9在那里诱导双链断裂（DSB）。DSB主要通过易出错的非同源末端连接（NHEJ）途径修复，产生插入或缺失，从而破坏基因功能。在某些情况下，存在供体DNA的情况下可以发生同源定向修复（HDR），实现精确的序列修饰。由于Marchantia的单倍体优势生活周期，编辑后的突变直接在配子体世代中表达，从而便于快速筛选突变体和下游功能分析。

除了基于CRISPR的基因组编辑外，如Cre-loxP系统这样的位点特异性重组系统也为条件性基因操作提供了强大的框架。在这种方法中，由loxP位点包围的基因组区域可以在Cre重组酶表达后被切除，从而实现基因破坏的空间或时间控制（Leneuve等人，2003年；Pangas等人，2006年；Taylor等人，2019年）。条件性系统特别适用于研究那些其持续丢失会导致严重发育缺陷或致死的基因。重组的特异性由Cre驱动因子决定，该驱动因子可以在组织特异性启动子或可诱导系统（如CreER变体）下表达，以实现重组的时间调控（Pugach等人，2015年；Antonson等人，2016年）。报告基因构建体常用于监测重组效率和空间活性，从而在体内验证基因操作（Mao等人，1999年），而基于PCR的基因分型和分子分析提供了额外的重组成功确认（Taylor等人，2019年；Nakata等人，2021年）。尽管其具有多功能性，但仍需要仔细的实验设计，因为重组效率可能因位点和组织而异，而且Cre表达本身在某些情况下可能会引起意外的细胞效应（Pugach等人，2015年；Arguello和Moraes，2015年）。Cre-loxP系统仍然是与基于CRISPR的基因组编辑方法相辅相成的宝贵策略。在包括Marchantia在内的植物中，同源定向修复（HDR）的效率较低是一个显著的限制，而HDR是实现精确基因替换或敲入所必需的。提高HDR效率的策略，如抑制NHEJ因子或使用基于病毒的载体来提供供体DNA模板，是目前研究的热点领域（Huang和Puchta 2019；Movahedi等人2022）。为了规避双链断裂（DSBs）和HDR的需求，已经开发出了更先进的CRISPR衍生碱基编辑器和引导编辑器（图2）。碱基编辑器能够直接且不可逆地将一个碱基对转换为另一个碱基对（例如，C-G转换为T-A），而无需DSBs（Molla等人2021），而引导编辑器则提供了更大的灵活性，可以用于所有可能的碱基变化以及小的插入和删除（Huang和Puchta 2021）。尽管在Marchantia中的应用尚未得到广泛报道，但它们在其他植物中的成功（Zhang等人2023；Cao等人2024）表明，它们在引入精确、可预测的突变以进行功能分析和性状工程方面具有巨大潜力。

在CRISPR/Cas9被广泛采用之前，转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）是靶向诱变的关键技术。TALENs由一个可定制的DNA结合域与FokI核酸酶域融合而成，后者需要二聚化才能切割DNA（Chen和Gao 2013）。Kopischke等人（2017）证明了TALENs在Marchantia中的高效率，使得MpNOP1基因的突变率超过了20%。TALENs的一个特别优势是它们能够产生高频率的框内突变，这对于研究完全敲除会导致死亡的关键基因非常宝贵，因为它们允许对特定蛋白质结构域进行功能分析。尽管由于CRISPR/Cas9设计更简单且通量更高，已经在很大程度上取代了TALENs，但工具的选择可能取决于具体的实验需求。这两种系统在Marchantia中的高效率为研究人员提供了灵活性。现在的主要挑战不在于突变机制本身，而在于提高HDR的效率以实现精确编辑，以及将新的编辑器（如引导编辑器）适应于该模型。

任何诱变策略的有效性都取决于能否高效地将其传递到植物细胞中。Marchantia特别适合进行遗传转化，已经建立了多种方法。**农杆菌介导的转化**是最常见的稳定转化方法。Ishizaki等人（2008）开发了一种使用孢子体的稳健协议，这成为Marchantia功能基因组学研究的基石。最近的改进，如“切碎的叶状体”方法（Batth等人2025），通过增加暴露于农杆菌的可再生组织表面积进一步提高了效率。基于孢子的转化协议还能够高效生成突变群体（Boehm等人2017；Yorker等人2025）。**粒子轰击**是一种替代的传递方法，特别适用于不易被农杆菌感染的生物体。该方法涉及将涂有DNA的金属颗粒推进到植物细胞中。这种方法已成功用于直接转化Marchantia的叶状体，在8-10周内产生稳定转化体（Takenaka等人2000），后来的协议将这一时间缩短至仅4周（Chiyoda等人2008）。轰击的一个显著缺点是它可能导致复杂的插入模式、潜在的内源基因破坏以及载体骨架序列的整合（Schouten和Jacobsen 2007）。因此，对于大多数应用来说，由于农杆菌介导的转化倾向于产生更简单、更可预测的T-DNA整合事件，因此更受青睐。除了基因破坏外，T-DNA插入方法还可以在同一筛选过程中产生功能丧失和功能获得突变，为阐明基因功能提供了强大的策略（Bowman等人2022）。

成功的转化只是第一步；可靠的转基因表达对于功能研究、互补作用和高级编辑（例如HDR）至关重要。在Marchantia中，转基因表达的不一致性一直是一个持续存在的挑战，这通常归因于位置效应、转基因沉默以及强组成型启动子的有限可用性。虽然像MpEF1α和MpACT这样的启动子被广泛使用（Ghosh等人2016；Kopischke等人2017），但它们的活性可能会有所不同。最近的工作开始通过系统地优化和测试新的启动子和合成调控元件来解决这个问题，以实现不同组织和发育阶段的稳健和可预测的表达（Tse等人2024）。对于需要精确时间和空间控制基因表达的应用（如代谢工程或需要调控表达以最小化脱靶效应的CRISPR编辑器的部署），解决这一挑战至关重要。

用于M. polymorpha的多种诱变工具各有优势和理想的应用场景，如表1所示。方法的选择取决于具体的研究目标。对于无偏见的表型驱动筛选，随机诱变方法是不可或缺的。重离子束照射目前提供了最高的效率和多样的突变谱。对于测试关于特定基因的假设，像CRISPR/Cas9这样的靶向编辑工具在生成敲除方面的速度和精度无与伦比。虽然仍在发展中，但碱基编辑和引导编辑代表了引入特定核苷酸变化以研究蛋白质功能和进行性状工程的未来方向。

未来有几个令人兴奋的前沿。首先，研究界必须开发标准化、优化的随机诱变协议（例如EMS、重离子）来构建大型、公开可用的突变库。其次，提高HDR效率并适应Marchantia的碱基/引导编辑将解锁精确的基因组工程。第三，通过合成生物学方法解决转基因表达的变异性对于复杂的遗传操作至关重要。最后，将这些诱变工具与高通量表型分析和测序技术相结合，将使得能够从系统层面理解这种进化上关键的植物的基因功能。

**结论**：Marchantia polymorpha已经牢固地确立了自己作为遗传模型系统的地位，这一地位得益于一套复杂且不断发展的诱导诱变技术工具箱。从产生随机多样性的经典方法到基于CRISPR的精确基因组操作，这些工具正在帮助研究人员剖析这种基础陆地植物的发育、进化和适应性的遗传基础。Marchantia的单倍体特性和基因组的简单性提供了一个独特的透明视角来观察基因功能。随着这些工具的不断进化，变得越来越高效和精确，M. polymorpha有望为我们在植物生物学的基本理解做出更大的贡献，并作为生物技术创新的试验平台。Marchantia研究的未来充满希望，其诱变工具的持续改进和智能应用将推动这一领域的发展。