基于氨基酸分析，采用质量平衡法和同位素稀释质谱技术对肽类Sublancin进行可追溯纯度鉴定

《Journal of Chromatography B》：SI-traceable purity assignment for peptide sublancin using mass balance approach and isotope dilution mass spectrometry based on amino acid analysis

　　

陈文文|严静静|杨梦瑞|王敏|周健|李福凯|李亮

中国农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所农业食品安全与质量重点实验室，北京100081，中国

摘要

准确测量肽类物质Sublancin的纯度对于其在饲料添加剂中的应用至关重要。在本研究中，通过半制备型色谱法从粗样品中分离并纯化了Sublancin。对于纯化的Sublancin样品，采用质量平衡（MB）和基于氨基酸的同位素稀释质谱（AA-IDMS）方法建立了可追溯的纯度测定策略。通过质量平衡法测得的绝对纯度为78.60%±0.27%，其中包含了5.46%的水分、0.4%的结构相关有机化合物、15.48%的三氟乙酸根离子残留物以及0.056%的无机杂质。优化了苯丙氨酸（Phe）、丙氨酸（Ala）和亮氨酸（Leu）的水解条件后，通过AA-ID-LC-MS/MS测得的纯度为77.58%±0.34%。此外，还对测量不确定性进行了全面评估。因此，最终确定的纯度值为78.1%，不确定性为1.5%。这些建立的方法可用于Sublancin的可追溯测定及认证参考物质的开发。

引言

Sublancin由37个氨基酸组成，是从Bacillus subtilis菌株中分离得到的一种生物活性肽[1]。Sublancin结构稳定，具有较高的耐热性、耐酸碱性以及耐胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力。它对革兰氏阳性细菌具有抗菌作用，其抗菌谱包括Bacillus megaterium、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes和Clostridium perfringens[2]。Sublancin可通过调节先天免疫反应和微生物群落，在预防和控制耐甲氧西林的Staphylococcus aureus感染中发挥关键作用。此外，它还能改善肠道黏膜的形态和结构，并调整肠道菌群组成，从而显著促进机体生长并增强免疫功能[3]。研究还表明，Sublancin能够有效激活巨噬细胞并提升小鼠的免疫功能[4]、[5]、[6]。

研究表明，Sublancin可以刺激产蛋鸡免疫器官的发育，并上调免疫细胞中免疫分子的表达和分泌。这些作用共同增强了体液的和适应性免疫，从而改善了家禽的免疫反应。此外，Sublancin还能缓解由Clostridium perfringens引起的坏死性肠炎，减轻肠道炎症，并在病原体挑战下提高肉鸡的生长性能。因此，Sublancin作为抗菌肽饲料添加剂于2022年首次获得中国农业农村部的批准和正式授权。相关产品标准文件NYSL-1004-2022《饲料添加剂 – Sublancin》已经制定，这标志着抗菌肽在动物营养领域的应用迈出了重要一步。该标准规定肉鸡复合饲料中Sublancin的推荐添加量为1.5–6.0 mg/kg。为了建立有效的质量控制（QC）措施，确保Sublancin在饲料添加剂中的安全生产和应用，从而保障动物源性食品安全并促进产业可持续发展，2025年启动了使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定Sublancin的国家农业行业标准项目。尽管以往的研究主要集中在Sublancin的生物活性和生产上，但尚未建立其可追溯的测量方法。这会影响NYSL-1004-2022标准的实施。认证参考物质（CRMs）在确保测量结果的准确性、可靠性和可追溯性方面一直发挥着重要作用。然而，由于缺乏高阶测量方法，目前尚无可追溯的Sublancin认证参考物质。

目前关于Sublancin的测量方法报道较少。虽然HPLC方法被广泛使用，但在准确量化纯Sublancin的主要成分方面存在局限性。因此，为了开发用于Sublancin测量的可追溯认证参考物质（CRMs），除了制备纯原料外，建立可追溯的高阶测量方法至关重要。主要的肽类分析高阶测量方法包括质量平衡法（MB）[7]、定量核磁共振（qNMR）[8]和同位素稀释质谱（IDMS）[9]，后者进一步包括基于水解氨基酸的IDMS[10]、基于特征肽的IDMS[11]、[12]以及基于元素的IDMS技术[13]、[14]。这些方法已被广泛用于建立可追溯的测量程序和开发肽类、蛋白质及相关生物分子的认证参考物质（CRMs）。全球各国计量机构（NMIs）在CRMs开发和国际比对项目中常规使用这些方法。质量平衡法是一种间接测量方法，通过扣除结构相关杂质、水分、挥发性成分和无机成分等来获得主要成分的纯度值。该方法已应用于牛血清白蛋白[15]和重组人生长激素[16]的测量。qNMR因其简单性、高准确性和直接的可追溯性而得到广泛应用[8]，但由于肽或蛋白质等大分子的谱线复杂且重叠，通常难以找到合适的内部标准和定量NMR峰，因此不太适合用于肽和蛋白质的测量。因此，已被公认为权威方法的IDMS在肽和蛋白质的测量及相关CRMs的开发中变得非常流行[17]、[18]、[19]，其测量结果更准确可靠，并可直接追溯到国际单位[20]、[21]、[22]。

对于AA-IDMS，肽类或蛋白质需要完全水解为氨基酸。文献报道显示，包括脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸在内的氨基酸在水解过程中能够保持稳定[23]、[24]。通过精确测量这些特定氨基酸来计算肽和蛋白质的准确含量[14]。因此，水解过程对于氨基酸的测定至关重要。通常需要系统优化水解的温度、反应时间和盐酸浓度[19]。此外，还需要考虑添加氮气或苯酚以减少水解过程中的副反应[25]。

本研究旨在建立Sublancin的可追溯纯度测定方法，采用半制备型高效液相色谱法从粗样品中分离并纯化Sublancin。纯化后的样品通过质谱法进行鉴定分析。Sublancin的纯度表征采用了质量平衡法和基于氨基酸的同位素稀释液相色谱-质谱（AA-ID-LC-MS/MS）方法。对两种独立方法的测量结果进行了统计分析，并全面评估了测量过程中引入的不确定性。

章节摘录

材料与设备

粗Sublancin样品由中农英泰有限公司提供。纯化的亮氨酸（Leu）GBW(E)100,058（纯度99.1±1.5%）、苯丙氨酸（Phe）GBW(E)100,061（纯度99.9±1.5%）和丙氨酸（Ala）GBW(E)100,054（纯度99.4±1.5%）由中国国家计量研究院（NIM）购买。稳定的同位素标记氨基酸（L-AAs），即苯丙氨酸（L-Phe）、丙氨酸（L-Ala）和亮氨酸（L-Leu），被用作AA-IDMS的内标

Sublancin的纯化与定性分析

通常，纯原料中未知的结构相关有机杂质会对主要成分的准确测定产生较大影响，尤其是在肽和蛋白质的AA-IDMS测量中，可能导致显著偏差。此外，对未知杂质的定性研究需要耗费大量时间和精力。如图1所示，通过HPLC-UV检测到Sublancin原料中存在大量不可忽视的结构相关杂质

结论

本研究成功建立了一种优化的纯化方案，使Sublancin的色谱纯度显著提高至99%以上。使用AA-ID-LC-MS/MS可以显著减少微量杂质引起的测量误差，同时这些微量结构相关杂质未被识别。对于Sublancin，建立了两种独立的可追溯纯度测定方法，包括质量平衡法（MB）和AA-ID-LC-MS/MS，测得的纯度为

CRediT作者贡献声明

陈文文：撰写——初稿、方法学设计、概念构思。严静静：方法学设计、数据管理。杨梦瑞：撰写——审稿与编辑、监督、研究经费获取。王敏：验证、数据分析。周健：验证、数据分析。李福凯：验证、数据管理。李亮：验证。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

中国国家重点研发计划（2023YFF0724503）的财政支持。