《Genes》：Identification of Radiation-Induced Injury Pathways and Hub Genes from RNA-Seq Data Based on Integrative Bioinformatics Approach
Khalish Arsy Al Khairy Siregar,
Chi-Ho Lee,
Jong-Jin Kim,
Dong-Jo Chang and
Seung-Hyun Jeong
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本研究旨在解决辐射诱导骨髓损伤的关键分子机制尚不完全明确的问题。研究人员采用整合生物信息学方法，对全身照射后小鼠骨髓造血干细胞的RNA-Seq数据进行了系统性分析。研究鉴定了与细胞因子信号、造血调控、免疫应答及胞外基质重塑相关的关键信号通路，并识别出Il6、Cd34、Gypa、Pdgfrb四个共识性枢纽基因。该研究为理解辐射性造血损伤的分子网络提供了系统性见解，并指出了潜在的研究靶点。
想象一下，你的骨骼内部有一个24小时不间断运作的精妙工厂——骨髓。它是人体生产各类血细胞的“总司令部”，维持着我们免疫、凝血和供氧等生命活动。然而，这个司令部有一个致命的弱点：对电离辐射极度敏感。无论是肿瘤放射治疗、核事故还是职业暴露，一旦遭受过量辐射，骨髓工厂就会“停摆”，导致急性骨髓抑制，患者面临感染、出血、贫血乃至死亡的风险。目前，临床管理主要依赖支持性治疗和造血生长因子，但效果有限，尤其对造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell, HSC）的长期功能恢复乏力。其根本原因在于，驱动辐射损伤后骨髓“停工”与“修复”的分子网络尚未被完全阐明。这就像一个复杂的电路板，我们知道它坏了，但还不清楚哪些核心元件是故障的关键。
为了破解这个难题，Khalish Arsy Al Khairy Siregar、Chi-Ho Lee、Jong-Jin Kim、Dong-Jo Chang 和 Seung-Hyun Jeong 的研究团队在《Genes》期刊上发表了一项研究，他们扮演了“分子电路侦探”的角色，利用公开的小鼠骨髓HSC的RNA测序（RNA-seq）数据，通过一套整合的生物信息学“工具箱”，系统性地描绘了辐射损伤后的基因表达蓝图，并精准定位了控制整个“电路”的关键枢纽。他们发现，辐射损伤远非简单的细胞杀伤，而是触发了一场涉及炎症风暴、造血程序重编程和骨髓“微环境”结构重塑的协同反应。更关键的是，他们从成千上万的基因变化中，揪出了四个稳定出现的“核心嫌疑人”——Il6、Cd34、Gypa和Pdgfrb，它们分别掌控着炎症信号、造血调控、红细胞动态和微环境修复，可能是未来干预辐射损伤的关键靶点。
本研究主要运用的关键技术方法包括：从公共数据库获取并处理小鼠骨髓HSC的RNA-seq原始数据；使用FastQC和fastp软件进行测序质量控制和数据预处理；利用HISAT2将高质量序列比对到小鼠参考基因组，并使用featureCounts进行基因表达定量；采用limma-voom和DESeq2两种独立的统计学方法进行差异表达分析；通过Gene Ontology (GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库进行功能富集分析，并辅以Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)从全转录组层面评估通路变化；基于STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，并运用Cytoscape软件的CytoNCA和CytoHubba插件，通过网络拓扑参数识别枢纽基因。
3. 结果
3.1. 质量控制和比对结果
所有RNA-Seq样本均显示出良好的测序质量，Phred分数在大多数碱基位置> Q30，GC含量一致，经过fastp修剪后，过度代表性序列和接头污染水平较低。随后使用HISAT2将高质量读段与小鼠参考基因组进行比对，获得了较高的总体比对率，为后续的差异表达分析奠定了可靠的数据基础。
3.2. 差异表达分析结果
为识别辐射后的转录组变化，研究并行使用了limma-voom和DESeq2两种分析方法。样本间距离分析和主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）均显示，对照组和照射组样本能清晰地按生物学条件聚类和分离。两种方法分别识别出601个和744个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），其中上调与下调的基因均有分布。尽管DEGs数量因方法而异，但基因变化方向和主要的候选基因模式在两个分析中基本一致，表明两种方法都捕获了相似的关键辐射应答转录特征。
3.3. DEGs的功能富集分析结果
通过功能富集分析深入理解了DEGs的生物学背景。基因本体（Gene Ontology, GO）分析表明，DEGs显著富集于适应性免疫应答、止血/凝血过程以及细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）成分改变等过程。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析进一步揭示，细胞因子-细胞因子受体相互作用、造血细胞谱系、JAK-STAT信号通路和PI3K-Akt信号通路是关键分子轴。GSEA结果补充显示，辐射诱导了与mTORC1信号、未折叠蛋白反应、IL6–JAK–STAT3信号等相关通路的激活，同时抑制了血红素代谢、干扰素-α反应等通路。这些结果一致表明，辐射暴露与免疫/炎症程序、造血功能、代谢应激反应及组织微环境动态的协同变化相关。
3.4. 蛋白质-蛋白质相互作用网络与枢纽基因模块分析结果
为探索DEGs产物间的功能关系，研究对两种方法识别的DEGs分别构建了PPI网络并进行拓扑分析。在limma-voom和DESeq2构建的PPI网络中，通过逐步筛选核心模块并结合多种中心性算法进行验证，最终发现四个基因在两种分析中均被一致识别为枢纽基因：Il6、Cd34、Gypa和Pdgfrb。它们在辐射后均表现出一致性的下调表达模式。从生物学功能看，这四个基因分别关联炎症信号（Il6）、造血稳态与分化（Cd34和Gypa）、以及通过生长和基质信号进行的微环境调控（Pdgfrb）。
4. 讨论与结论
研究表明，辐射诱导的骨髓损伤与细胞因子信号通路和免疫学反应的紊乱密切相关，特别是细胞因子-细胞因子受体相互作用通路，包括JAK/STAT和PI3K-Akt。此外，与造血和细胞外基质相关的术语富集提示，微环境或生态位动态、组织重塑以及造血区室的变化可能在辐射后的生物学应答中发挥作用。本研究确定的四个枢纽基因（Il6、Cd34、Gypa、Pdgfrb）代表了调控炎症信号、造血稳态和细胞-生态位相互作用中互补的生物学轴。这些发现支持了骨髓对辐射的应答不仅涉及急性炎症激活，还包括造血程序及其支持微环境的变化这一观点。
然而，需要强调的是，本研究的分析基于单一时间点（照射后3天）和单一剂量（5 Gy）的公共数据集，所观察到的差异表达模式可能部分反映了辐射应激后分选HSC群体内细胞组成的变化。因此，识别出的枢纽基因应被解释为与辐射诱导骨髓损伤相关的候选调控标记物，而非明确的驱动因子或已验证的生物标志物。
通过采用不依赖于单一分析方法的计算策略，本研究为理解辐射诱导造血损伤相关的潜在分子轴提供了系统层面的视角，并优先确定了可作为进一步研究辐射损伤评估的分子参考点的候选基因。未来需要通过RT-qPCR、蛋白表达分析和功能扰动实验等独立实验验证这些候选基因的生物学相关性。此外，结合转录因子推断等方法的未来整合分析，将有助于揭示驱动这些枢纽基因表达变化的上游调控网络，为深入理解辐射后造血损伤与恢复机制、开发生物剂量学评估新策略奠定基础。
