《Bioresource Technology》：Computational-Guided semi-rational design to Reprogram Phospholipase D into Industrially Robust enzyme
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磷脂酶D（PLD）通过结合祖先序列重建（ASR）与吉布斯自由能计算（ΔΔG），成功开发PLD_M5突变体，其半衰期在50℃下提升415倍，熔点达71.6℃，催化效率保持78.8%转化率及39.4 g/L/h产率，协同增强结构刚性。
Xiao-Li Kong|Peng Zhang|Zheng-Qiang Qin|Chang Su|Heng Li|Zhen-Ming Lu|Jin-Song Gong|Zheng-Hong Xu|Jin-Song Shi
中国江苏省无锡市江南大学生命科学与健康工程学院，教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，邮编214122
摘要
磷脂酶D（PLD）能够催化磷脂衍生物的合成，这些衍生物具有重要的应用价值和市场潜力。然而，大多数已报道的PLD热稳定性较差，熔点低于60°C，限制了其工业应用。本研究采用了一种计算机辅助设计策略，结合祖先序列重建（ASR）和Gibbs折叠自由能（ΔΔG）计算来提高PLD的热稳定性。通过迭代累积突变，生成了一种组合突变体PLDM5。其熔点和在50°C下的半衰期分别提高了13.4°C和415倍。同时，该突变体保持了有效的催化性能，磷脂酰丝氨酸转化率为78.8%，产率为39.4克/升/小时。结构和动力学模拟表明，ASR和ΔΔG突变通过不同的机制协同增强了结构刚性。这项工作扩展了PLD的工业应用范围，使其能够在高温下催化磷脂反应。
引言
磷脂酶D（PLD）能够催化磷脂中的磷酯键水解生成磷脂酸，更重要的是，它还能介导转磷脂化反应，生成各种磷脂衍生物（Zhang等人，2025a）。这种独特的催化多样性使PLD成为合成稀有天然磷脂衍生物（如磷脂酰丝氨酸（PS）（Li等人，2022b）、磷脂酰乙醇胺（Wu等人，2025）和磷脂酰甘油（Li等人，2018））以及非天然磷脂衍生物（如磷脂酰羟基丁酸（Li等人，2019））的宝贵生物催化剂。这些化合物在制药、食品、日用化学品等领域有广泛的应用（Zhang等人，2020）。作为这些反应的生物催化剂，PLD表现出高催化活性、强可控性和环境友好性，凸显了其重要的工业潜力（Mao等人，2017）。
PLD存在于动物、植物和微生物中（Arhab等人，2019；Hu等人，2024；Wang等人，2021）。其中，来自微生物的PLD具有更高的转磷脂化活性和更广的底物特异性，因此相比其他来源的PLD受到了更多关注（Liu等人，2019）。然而，大多数野生型PLD的热稳定性较差，在高温、酸性或碱性条件下活性迅速下降，严重限制了其工业应用（Qi等人，2022）。鉴于较高的反应温度可以提高底物溶解度、加速反应速率、提高产品产量并减少潜在的微生物污染（Damnjanovi?等人，2014），提高PLD的热稳定性已成为研究的重点。
为了提高PLD的热稳定性，人们付出了大量努力。Huang等人利用易出错的PCR和高通量筛选方法鉴定出理想的突变体S163F，该突变体在50°C下的半衰期（t1/2）比野生型（WT）延长了3.04倍（Huang等人，2020）。然而，这种方法通常耗时且成本较高（Chu等人，2024）。因此，越来越倾向于使用理性或半理性设计策略作为更高效的酶工程方法（Xu等人，2025）。Damnjanovi?等人筛选了具有高B因子的残基并引入随机突变，所得突变体在65°C下的半衰期延长了8.7分钟（Damnjanovi?等人，2012）。Li等人在MsPLD的柔性区域引入了新的二硫键，最终突变体在35°C下的半衰期延长了3.1倍（Li等人，2022a）。尽管取得了这些进展，但这些策略仍存在局限性。B因子分析虽然有助于识别柔性区域，但仍需要大量的随机或饱和突变来鉴定有益突变体。二硫键工程对蛋白质模型有严格要求，有时会导致过度刚性化，从而影响催化活性。更重要的是，这些策略带来的改进相对有限，大多数变体的半衰期仅增加了不到10倍。因此，需要采用更有效的策略来实现显著的稳定性提升。
为克服这些挑战，我们开发了一种结合祖先序列重建（ASR）和Gibbs折叠自由能（ΔΔG）计算的集成半理性设计策略。ASR利用进化信息识别对维持整体结构稳定性至关重要的保守残基，而ΔΔG计算则评估单点替换的能量后果，从而识别出能够增强柔性区域内局部相互作用的突变。尽管这两种方法需要大量的同源序列和计算资源，但它们可以协同作用，实现整体骨架稳定性和局部结构强化。通过这种策略，我们构建了突变体PLDM5，其在50°C下的半衰期延长了415倍，熔点（Tm）提高了71.6°C。这项工作不仅提供了一种适用于工业高温生物催化的PLD变体，还为其他酶的热稳定性工程建立了一个通用框架。
菌株、质粒和材料
E. coli JM109和B. subtilis SCK6分别作为质粒克隆和蛋白质表达的宿主。PLD基因携带三个突变（E435G、V470I、A378S），最初来源于Streptomyces，并在PMApld4-SPestA载体质粒中表达（Zhang等人，2023；Zhang等人，2025a）。该基因作为后续热稳定性工程的模板，在后续描述中统一命名为PLDM0以保持清晰性和一致性。
PLD的结构建模
由于目标PLD的实验结构数据不可用，且同源模板覆盖范围有限，因此采用AlphaFold3进行结构预测，因为它在预测序列与已知结构相似性较低的蛋白质时具有高准确性。PLD的整体结构呈马鞍形，活性位点包含两个“HxKxxxxD”催化基序，位于结构的中央区域。在选定的五个突变位点中，G188位于一个环状结构上
结论
本研究表明，将祖先序列重建与Gibbs自由能计算相结合是提高酶热稳定性的有效策略。通过将这种方法应用于PLD，我们成功生成了一种热稳定性和催化性能显著提高的组合突变体。该突变体在50°C下的PS转化率接近80%，并在放大实验中保持了高合成效率。
CRediT作者贡献声明
Xiao-Li Kong：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。Peng Zhang：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、软件开发、数据分析。Zheng-Qiang Qin：软件开发、数据分析。Chang Su：撰写 – 审稿与编辑、实验研究。Heng Li：撰写 – 审稿与编辑、实验研究。Zhen-Ming Lu：实验研究、资金获取、数据管理、概念构思。Jin-Song Gong：实验研究、资金支持
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32571699）、山东省泰山产业领军人才计划（项目编号：tscx202408107）以及江苏省的研究生研究与实践创新计划（项目编号：SJCX24_1368）的财政支持。
