《Cancer Letters》：Targeting tumor-intrinsic CDK1/Cyclin B1 complex improves responses to immunotherapy in pancreatic cancer
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胰腺癌免疫治疗响应不足源于肿瘤微环境中T细胞激活和浸润缺陷，本研究通过体内CRISPR-Cas9筛选发现CDK1/Cyclin B1复合物作为新型肿瘤内免疫逃逸驱动因子，其抑制可增强GM-CSF介导的cDC1s招募，提升NF-κB活性促进T细胞浸润，协同PD-1阻断显著抑制肿瘤生长。
李博泰|魏鹏|谢宝文|钟轩|王晓双|娄新怡|张婷|陈东
上海交通大学医学院附属仁济医院上海免疫治疗研究所，中国上海200127
摘要
免疫疗法，尤其是免疫检查点阻断疗法，在多种癌症治疗中取得了显著成效；然而，对于“冷肿瘤”（尤其是胰腺癌）患者，这种疗法的效果较差，这主要是由于肿瘤微环境（TME）中T细胞激活和浸润不足。为了探究肿瘤细胞调控T细胞激活的机制，我们进行了体内CRISPR-Cas9筛选，并发现CDK1/Cyclin B1复合物是胰腺癌中一个先前未被识别的免疫逃逸驱动因素。通过基因敲除或药物抑制CDK1/Cyclin B1复合物，可以诱导T细胞浸润增强的TME环境，这与PD-1阻断疗法协同作用，从而抑制肿瘤生长。机制上，Ccnb1的缺失减少了视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）在S249/T252位点的磷酸化，恢复了NF-κB的活性，进而增加了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的产生，并促进了常规1型树突状细胞的招募和激活。这些发现揭示了CDK1/Cyclin B1复合物在肿瘤免疫逃逸中的作用，为将CDK1/Cyclin B1抑制与PD-1阻断联合用于胰腺癌治疗提供了有力依据。
引言
免疫疗法，尤其是免疫检查点阻断疗法，在多种癌症治疗中取得了显著成效。然而，在免疫学上“冷”的肿瘤（尤其是胰腺癌）中，其疗效仍然有限，胰腺癌的五年生存率低于10%[1]。胰腺癌的一个关键特征是肿瘤微环境（TME）中细胞毒性CD8+ T细胞的数量不足且功能失调，这与“热肿瘤”中丰富的T细胞浸润形成鲜明对比[2], [3]。越来越多的证据表明，这种缺陷与常规1型树突状细胞（cDC1s）的数量不足和活性受损有关，而cDC1s对于有效启动和维持抗肿瘤CD8+ T细胞反应至关重要[4], [5]。胰腺肿瘤中功能性cDC1s的缺乏不仅削弱了T细胞免疫，还直接导致该癌症对免疫检查点阻断（ICB）和过继T细胞疗法（ACT）具有很强的抵抗力[3], [5], [6]。尽管cDC1s在调节肿瘤免疫中的关键作用已被广泛认可，但促进或抑制cDC1招募和功能的肿瘤内在机制在胰腺癌中的具体机制仍不清楚。
越来越多的证据表明，肿瘤内在机制在免疫逃逸中起着关键作用，主要通过损害抗原呈递来逃避CD8+ T细胞的识别，或者限制CD8+ T细胞在TME中的浸润和激活[7], [8]。肿瘤细胞中的多种致癌信号通路参与了抗肿瘤免疫的调节[9]。例如，WNT/β-连环蛋白通路的激活会抑制树突状细胞（DC）的招募和CD8+ T细胞的活化，从而促进黑色素瘤和肝细胞癌的免疫排斥和对抗ICB的抵抗力[10], [11]。类似地，在PTEN缺陷肿瘤中抑制PI3Kβ可以激发强烈的抗肿瘤免疫，并与ICB在黑色素瘤和乳腺癌的临床前模型中产生协同效应[12], [13]。此外，抑制CDK4/6还可以上调MHC-I的表达，促进T细胞浸润增强的TME环境，从而提高乳腺癌对PD-1阻断的响应性[14]。这些发现突显了靶向肿瘤内在通路以重塑免疫景观并提高免疫疗法疗效的潜力。然而，胰腺癌具体如何调控免疫逃逸的机制仍不明确，寻找能够提高胰腺癌免疫疗法疗效的可操作靶点仍然是一个亟待解决的问题。
基于CRISPR-Cas9的功能基因组筛选为无偏识别新的免疫调节因子提供了强大平台[15], [16], [17]。单细胞体外CRISPR筛选通过流式细胞术筛选出了PD-L1[18], CD58[19], [20]和MHC-I[21]等关键免疫分子的调节因子。双细胞类型筛选平台通过将基因改造的肿瘤细胞与细胞毒性免疫细胞（如CD8+ T细胞或NK细胞）共培养，成功识别出影响免疫介导的细胞毒性的基因[22], [23], [24]。为了更好地模拟TME的复杂性，研究人员将基因改造的肿瘤细胞移植到同基因小鼠体内，并在特定的免疫条件下进行体内筛选[25], [26], [27], [28], [29], [30]。尽管这些方法已在多种癌症类型中成功识别出免疫调节因子，但在胰腺癌中的应用仍有限。
在这项研究中，我们在原位胰腺癌模型中进行了体内CRISPR-Cas9筛选，以识别肿瘤内在的免疫逃逸调节因子。研究发现CDK1/Cyclin B1复合物是一个先前未被发现的抗肿瘤免疫抑制因子。机制上，CDK1/Cyclin B1复合物通过维持Rb介导的NF-κB信号通路抑制，从而限制了GM-CSF的产生，削弱了cDC1的招募并限制了CD8+ T细胞的活化。这些发现揭示了CDK1/Cyclin B1复合物的非传统免疫调节作用，并表明抑制该复合物可能是提高胰腺癌免疫疗法疗效的有效策略。
部分摘录
体内CRISPR筛选发现胰腺癌中的肿瘤内在免疫逃逸调节因子
为了评估cDC1浸润在胰腺癌中的临床重要性，我们使用CLEC9A（一种公认的cDC1标记物）分析了TCGA数据集。CLEC9A的高表达与总体生存时间和无病生存时间的延长显著相关（图S1a），表明cDC1数量的增加可以抑制胰腺癌的进展。为了验证胰腺癌内在机制限制cDC1功能的假设，我们在原位模型中进行了体内CRISPR-Cas9筛选
讨论
胰腺癌对免疫疗法仍然具有高度耐药性，主要是由于CD8+ T细胞浸润有限以及TME具有强烈的免疫抑制作用[2], [46], [47], [48], [49]。通过体内CRISPR-Cas9筛选，我们发现CDK1/Cyclin B1复合物是肿瘤内在的免疫逃逸调节因子。基因敲除或药物抑制该复合物可以增强cDC1介导的CD8+ T细胞活化，从而使肿瘤对免疫疗法更加敏感（图7f）。
小鼠
野生型（WT）C57BL/6小鼠来自南京GemPharmatech（中国南京）。Csf2rb-/-, Batf3-/-, Tcrbd-/-和OT-I小鼠由我们实验室自行饲养。所有小鼠均在上海交通大学仁济医院的无特定病原体（SPF）动物设施中饲养，环境温度控制在20-22°C，湿度为50-70%，光照周期为12小时。小鼠可自由摄取食物和水。使用6-8周龄的雄性或雌性小鼠。所有动物实验均遵循相关伦理规范。CRediT作者贡献声明
谢宝文：数据可视化、实验设计。魏鹏：数据可视化、实验设计。王晓双：数据可视化、实验设计。钟轩：数据可视化、实验设计。李博泰：论文撰写-审稿与编辑、初稿撰写、数据验证、方法学设计、实验设计、资金申请、数据分析、概念构思。张婷：论文撰写-审稿与编辑、实验设计、监督、概念构思。娄新怡：数据可视化、实验设计。陈东：论文撰写-利益冲突
C.D.是Kanova和Bennu Biotherapeutics的创始人。
数据可用性声明
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：C.D.是Kanova和Bennu Biotherapeutics的创始人。其余作者无利益冲突。
致谢
我们感谢张志刚博士（中国上海交通大学）慷慨提供FC1199细胞。
本项目得到了国家自然科学基金（31991173, 31991170, 82202977）、杭州市免疫疾病与精准治疗重点医学学科建设基金（2025HZGFO1）、CAMS医学科学创新基金（2022-I2M-5-01）、中国国家创新人才博士后计划（BX20211187）等项目的支持。
