高效靶向人PD-L1的化合物库高通量筛选方法

《ACS Omega》：Efficient Method for High-Throughput Screening of Compound Libraries Targeting Human PD-L1

　　

DNA连接抑制剂抗体检测（DIANA）是一种稳健的高通量筛选平台，专为识别和表征靶向人PD-L1的低分子量抑制剂而优化。该平台整合了竞争性结合与定量聚合酶链反应（qPCR）检测，能够在单孔中测定解离常数（K_d），并快速筛选数千种化合物。研究人员使用三种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的单克隆抗体（atezolizumab、avelumab和durvalumab）、PD-L1结合大环肽WL12以及天然PD-1受体对该方法进行了验证，得到的K_d值与文献报道一致。DIANA的动态范围超过4个数量级，具有优异的稳健性（Z′因子 = 0.94），并对二甲基亚砜（DMSO）具有高耐受性（最高10%）。研究人员应用DIANA筛选了两种化合物库：一个包含5280种化合物的内部库（混合格式）和一个包含1298种化合物的商业肽模拟库（个体格式）。虽然检测到非常弱的初始命中化合物，但在后续手动非高通量筛选实验或正交的基于细胞的检测中均未得到确认。尽管如此，DIANA的灵敏度、可扩展性和极低的样品需求使其成为加速发现下一代PD-1/PD-L1抑制剂并克服传统筛选方法关键局限性的有力工具。

**论文解读：基于DIANA平台的人PD-L1高通量筛选方法研究**

**研究背景与问题**

PD-1（程序性死亡受体1）/PD-L1（程序性死亡配体1）免疫检查点是癌症免疫治疗的关键靶点。PD-L1是一种由免疫细胞（如T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞）表达的跨膜蛋白，其与PD-1的相互作用在维持免疫耐受中发挥重要作用，防止过度免疫激活导致炎症和自身免疫。然而，肿瘤细胞通过表达PD-L1来利用这一通路，从而逃避免疫监视并抑制抗肿瘤反应。针对PD-1/PD-L1相互作用的单克隆抗体（mAbs）在临床上取得了成功，如atezolizumab、durvalumab和avelumab已获美国FDA批准用于多种癌症治疗。但这些抗体疗法存在局限性，包括生产成本高、肿瘤穿透性不佳以及潜在的免疫原性。因此，开发低分子量（LMW）化合物成为克服这些挑战的替代策略，但尚未有LMW抑制剂能达到与mAbs相当的疗效。通过先进的高通量筛选（HTS）方法寻找更有效的PD-1/PD-L1抑制剂仍是癌症免疫治疗研究的关键领域。

现有筛选方法存在诸多不足：表面等离子体共振（SPR）通量低且需要蛋白质固定；等温滴定量热法（ITC）、生物层干涉（BLI）、差示扫描荧光法（DSF）、微量热泳动（MST）等方法耗时长、材料消耗大；荧光偏振（FP）、F?rster共振能量转移（FRET）及时间分辨FRET（TR-FRET）虽然兼容板式HTS，但需要荧光标记且优化复杂。因此，亟需一种简单、快速、高灵敏度且适合大规模HTS的新方法。

**研究内容与结论**

研究人员开发了DNA连接抑制剂抗体检测（DIANA）平台，并将其应用于靶向人PD-L1的抑制剂高通量筛选。DIANA通过将靶向PD-L1的大环肽WL12与DNA寡核苷酸偶联形成检测探针，利用竞争性结合和qPCR检测，能够在单孔中测定化合物的解离常数（K_d）。该方法经验证具有宽动态范围（超过4个数量级）、高稳健性（Z′因子=0.94）和良好的DMSO耐受性（最高10%）。研究人员使用三种FDA批准的mAbs、WL12及天然PD-1受体进行验证，所得K_d值与文献报道的亲和力趋势一致。随后，研究人员应用DIANA筛选了两个化合物库：一个包含5280种化合物的内部库（IOCB库，采用混合格式，每孔11种化合物）和一个包含1298种化合物的商业α-螺旋肽模拟库（Otava Chemicals，采用个体格式）。在IOCB库筛选中，初始识别出24个弱命中化合物，经反筛（counter-screen）排除干扰后剩4个，但后续基于细胞的PD-1/PD-L1检测证实均为假阳性。在肽模拟库筛选中，识别出6个极弱命中化合物，但单独复测时未观察到抑制。尽管未获得可验证的生物活性命中，但极低的假阳性率（<0.5%）证明了DIANA的特异性和精确性。该研究首次实现了针对人PD-L1的自动化高通量筛选，也是首次将DIANA用于阻断蛋白-蛋白相互作用（PPI）的筛选，其中大环肽被用于探针开发。论文发表在《ACS Omega》。

**主要关键技术方法**

1. **DIANA检测探针制备**：通过铜催化的叠氮-炔基环加成反应（CuAAC），将叠氮基团修饰的PD-L1结合大环肽WL12与炔基修饰的DNA寡核苷酸偶联，纯化后得到DIANA检测探针。
2. **自动化高通量筛选流程**：利用Bravo自动化液体处理平台、Labcyte Echo 550纳升级液体处理器、BlueWasher自动洗板机和Mantis分液器等设备，在384孔板中实现全自动化操作，包括NeutrAvidin固定、抗His标签iBody捕获、His标签重组人PD-L1蛋白固定、检测探针与抑制剂竞争结合、qPCR检测等步骤。
3. **竞争性结合与qPCR检测**：将检测探针与待测化合物共孵育，通过qPCR定量结合到PD-L1上的探针量，计算ΔCq值评估抑制活性；利用单孔测量结合公式直接计算K_d值。
4. **反筛策略**：在饱和浓度WL12存在下重复筛选，排除因螯合或PCR抑制等干扰因素导致的假阳性。
5. **解卷积流程**：对于混合格式筛选的命中孔，将其中11种化合物逐一单独测试，确定具体活性化合物。

**研究结果**

**设计DIANA检测探针**：研究人员选择大环肽WL12作为靶向PD-L1的组分，利用其单一伯胺基团与DNA寡核苷酸通过CuAAC反应偶联，成功制备了PD-L1靶向的DIANA检测探针。

**DIANA的优化与验证**：研究人员优化了每孔PD-L1用量（185 pg）和探针浓度（200 pM），并验证了10% DMSO对检测无显著影响。优化后的检测窗口约为13个qPCR循环（超过4个数量级）。利用DIANA测定多种PD-L1结合剂的K_d值：atezolizumab为0.0023±0.0001 nM，avelumab为0.007±0.003 nM，durvalumab为0.0024±0.0003 nM，WL12为0.26±0.09 nM，PD-1为3.7±0.6 nM，这些值与文献报道的亲和力趋势一致。

**IOCB化合物库的HTS**：研究人员使用混合格式（每孔11种化合物）对5280种化合物进行筛选。检测窗口为13个循环，非抑制孔标准偏差为0.09 Cq，Z′因子为0.94。阳性对照WL12的K_d为0.26±0.09 nM。命中筛选阈值设为ΔCq≥0.80（超过8倍标准偏差）。初始识别出24个弱命中，反筛后排除4个非干扰性命中，但解卷积后只有2种来自同一孔的个体化合物。后续细胞检测证实所有候选化合物均为假阳性，这些化合物含有类似螯合剂的基团，干扰了PD-L1固定过程中TrisNTA与His标签的结合。

**商业肽模拟库的HTS**：研究人员以个体格式筛选了1298种α-螺旋肽模拟化合物。检测窗口为12.63个循环，非抑制孔标准偏差为0.18 Cq，Z′因子为0.94。阳性对照WL12的K_d为0.32±0.05 nM。命中阈值设为ΔCq≥0.66（3倍标准偏差）。初始识别出6个极弱命中，但单独复测时未观察到抑制，归因于自动化HTS与手动小规模实验之间的技术变异。

**总结讨论与结论**

**讨论部分**：PD-1/PD-L1相互作用的界面大而平坦（约1970 ?2），缺乏明确的结合口袋，使得小分子抑制剂的发现极具挑战。现有方法如SPR、ITC、MST等在通量、材料消耗或标记需求方面存在局限性。DIANA利用DNA标记和qPCR检测，具有极高灵敏度、极低的蛋白质和配体消耗量，无需蛋白质标记，可平行处理大量化合物库。研究人员展示DIANA的动态范围超过4个数量级，Z′因子>0.9，对DMSO耐受性良好（10%）。通过已知PD-L1结合剂验证，所得K_d值与文献报道的亲和力趋势一致，但绝对值存在偏差，这归因于方法差异（如DIANA基于溶液竞争平衡结合与qPCR检测，而SPR基于表面固定蛋白的动力学测量）、缓冲条件、温度和检测灵敏度等因素。DIANA能够在单孔中直接测定K_d，无需连续稀释，显著加速了结合亲和力的定量分析。尽管两个库的筛选均未获得可验证的活性命中，但这反映了所筛选库在规模和化学多样性方面的局限性，而非DIANA性能问题。极低的假阳性率（<0.5%）凸显了该平台的特异性和精确性。通过整合反筛步骤（使用已知PD-L1配体WL12），DIANA内置了针对假阳性的防护机制。

**研究结论**：DIANA是一个强大、高通量的平台，非常适合针对具有挑战性的蛋白-蛋白相互作用（如PD-1/PD-L1）的药物发现。它相对于传统方法具有显著优势，包括快速通量、单孔K_d测定、极低的样品需求以及兼容混合和个体化合物格式。未来计划将基于DIANA的筛选扩展到更广泛、化学多样性更丰富的化合物库（包括商业和学术库），以提升命中发现率；同时整合基于片段的药物发现和结构引导优化，进一步提高识别可行小分子抑制剂的可能性。