高精准长读长HiFi测序：让罕见病不再“难见”

国际罕见病日

每年 2 月的最后一天是 “国际罕见病日”。这个特殊的日子，不仅是为了唤起社会对罕见病群体的关注，更是为了推动医学进步，让每一个“罕见”的生命都能被看见、被诊断、被治愈。但现实是，超过半数的罕见病患者仍困在“诊断难”的困境里。由于病种繁多、临床表现复杂，传统短读长测序技术对结构变异、单倍型定相等关键信息解析力不足，许多患者在漫长的求医路上辗转奔波却始终无法找到病因，最终错失最佳干预时机。

如今，高精准长读长 HiFi 测序技术正在打破这一僵局，它凭借“长读长、高准确度、单分子分辨率”的优势，不仅能精准捕捉到传统短读长测序难以发现的复杂结构变异、重复序列扩增和嵌合突变，还能实现甲基化修饰的直接检测，为罕见病的病因解析、分子分型和精准治疗提供了前所未有的强大工具。

在国际罕见病日到来之际，我们将通过三篇前沿文献，带您见证 HiFi 测序如何在临床诊断、甲基化分析等领域大放异彩，为罕见病患者点亮希望之光。

罕见病难检变异的精准捕获利器

背景

传统短读长测序难以识别复杂结构变异、串联重复等难检变异，需多种互补检测技术联用，导致诊断流程繁琐、成本高昂。本研究聚焦 HiFi 测序在罕见病诊断中的应用，通过 100 份样本中的 145 个已知难检临床相关变异（含 25 例短串联重复序列扩增、34 例同源序列 / 假基因相关变异、23 例复杂结构变异），验证其技术优势与临床潜力。其中部分样本经短读长测序验证仅 41% 变异可自动检出。

关键研究设计

采用 PacBio Revio 平台进行HiFi WGS（目标覆盖度 30×），结合 Hifiasm 、PBSV 等工具进行变异检测与注释，同时评估 10×、15×、20× 覆盖度下的检测效能。

核心发现

 HiFi 测序展现出卓越的难检变异捕获能力：自动检测率达 83%（120/145），涵盖结构变异、STR 扩增、SNV / 插入缺失等类型；10%（14/145）变异经人工可视化验证可识别，总体检出率 93%（图1）。相比短读长测序，同源区域变异、复杂结构重排等检出效能提升显著，可成功解析 CEP85L 与 MCM9 基因间 200kb 复杂重排。

图1. 样本中可检出的变异类型（A），不同检测方法（B）及长读长测序的检出情况（C）

 单一技术覆盖全变异类型：无需多种检测技术联用，可同时精准捕获结构变异、STR 扩增、甲基化相关变异、线粒体变异等，也能区分同源序列/假基因区域变异，结合 T2T 完整参考基因组，还能解决 GRCh38 无法解析的染色体易位等复杂变异，提供更丰富的分子诊断信息。

 低覆盖度耐受性突出：15× 覆盖度下 90% 自动检出变异仍可识别，仅同源区域变异灵敏度略有下降，为临床规模化应用降低成本提供支撑。

局限与结论

7% （11/145）变异未检出，主要集中在 GA 基序重复扩增及50kb 以上大片段重复区域的结构变异断点。未来通过优化变异检测算法、整合低质量数据的针对性重新利用及靶向测序技术，可进一步突破现有局限。总体而言，HiFi 测序大幅超越传统短读长测序的难检变异识别能力，有望成为罕见病一线诊断技术，简化流程并提升分子诊断率。

罕见病临床一线诊断的规模化验证与突破

背景

短读长测序需多种互补检测技术联用，诊断流程繁琐，且部分复杂变异难以捕获。HiFi 测序有望整合现有检测体系为单一检测，但缺乏大规模临床验证，本研究通过 1000 份临床样本平行试验，评估其一线诊断可行性。

关键研究设计

纳入荷兰两所三级医学中心 2022 年 1000 份生殖系诊断临床样本（含 832 例先证者，84个家系三联体、748个单例），涵盖多系统罕见病。同步开展SoC（standard-of-care，标准诊疗）与基于 HiFi 测序的lrGS（Longread genome sequencing，长读长基因组测序），对比诊断一致性、新增诊断率，并建模评估将 HiFi 测序作为一线检测手段对 15150 例年度队列样本诊断效率的影响。

核心发现

 lrGS与 SoC 诊断一致性达 96.4%（802/832），3.4% （28/832）的病例实现诊断升级或修正（图2B、C）：① 检测到 SoC 遗漏的插入缺失、拷贝数变异（CNV）、结构变异（SV），或精确定位 CNV，将 5 例疑似诊断升级为确诊；② 借助单倍型定相信息，明确 21 例隐性遗传病的突变呈反式排列（确诊），2 例呈顺式排列（排除致病），大幅优化变异解读。仅 0.2% （2/832）病例漏检（图2B、C）:分别为 GJB2 基因 4% 低水平嵌合 SNV（需靶向深度测序）、TLK2 基因 1bp 新发缺失（lrGS 该位点覆盖度仅 16×）。

图2. IrGS与 SoC 的诊断结果对比

 lrGS可将诊断率从 SoC 的 16.5% 提升至 19.2%（图2B），且单倍型定相能力突出，可对91.4% 的基因内杂合变异对进行定相，≤39kb 的基因相位解析率达 98.7%，定相 N50 达 200kb（远高于短读长的0.8kb），无需家系样本即可区分隐性遗传病变异排列方式。可单一技术整合遗传 + 表观检测，识别 X 染色体失活偏倚，为变异致病性提供佐证。

 20× 覆盖度下 SNV/InDel 召回率仅下降 1.1%，仅漏诊 1-2 例，SV 召回率下降 3.6%，20× 覆盖度即可满足临床需求，大幅降低检测成本。建模显示，应用于 15150 例年度队列样本，诊断率可从 16.4% 提升至 18.9%，为超 500 例患者新增确诊机会。

局限与结论

对 GA 富集重复序列扩增、低比例嵌合变异等检测仍有不足，1.1% 的疾病基因存在覆盖度不足问题。但 HiFi 测序的高一致性、增量诊断价值及规模化潜力，可大幅简化诊断流程、缩短诊断时间，使其成为罕见病一线诊断的有力选择。本研究为罕见病基因诊断从“多技术迭代”向“单一长读长检测”的转型提供了关键证据。

罕见病甲基化检测与表观特征分析的革新工具

背景

DNA 甲基化异常与多种罕见病相关，表观特征可辅助变异致病性解读，但传统检测方法存在 DNA 降解、覆盖受限等问题。HiFi 测序可检测天然 5mC（无需额外 DNA 处理），还能实现变异单倍型定相，为甲基化检测提供新方案，但缺乏系统的医学应用验证。本研究验证其甲基化检测与表观特征分析的临床价值。

关键研究设计

通过 HG002 细胞系对 HiFi 测序与传统甲基化检测的一致性进行对比；纳入 10 个家系三联体（30 份样本），评估 25 个已知亲本印记区域检测准确性及低覆盖度耐受性；采用 12 例 KMT2A 致病变异患者、2 例 VUS（意义不明确的变异） 样本及 39 例对照，验证表观特征适用性。

核心发现

 HiFi 测序与传统甲基化检测的 CpG 位点重合率达 93%，Pearson 相关系数 > 0.9，可多检测5% 的 CpG 位点，其中 52.5% 位于着丝粒区域、73.4% 位于 ENCODE黑名单区域，弥补了传统技术在复杂基因组区域的检测空白；其从头检测模式还能发现 4.47% 的新 CpG 位点（含 55837 个 CpG 岛位点），这些位点多由基因组变异产生，对调控区域甲基化分析具有重要意义。

 印记区域检测精准率达 96%（24/25），准确区分父母源等位基因甲基化模式，单区域 CpG 覆盖量是 450K 芯片的 5 倍，与 WGBS 相当。15× 覆盖度下，与 30× 参考数据的 Pearson 相关系数达 0.8，支持双样本共测降低成本（图3）。

图3. PacBio长读长测序技术对三联体样本中25个稳定印记基因组区域的甲基化检测效能评估

 可直接应用已发表的 KMT2A 表观特征，精准区分患者与对照，将 2 例 VUS 样本归类为对照，为变异致病性重分类提供依据，且能同时捕获遗传变异与甲基化信息，简化联合诊断流程。

局限与结论

从头构建表观特征能力不足，需 300 例以上样本才能达到 80% 检测效能；对部分印记区域甲基化差异检测有欠缺。但 HiFi 测序的天然DNA检测、广覆盖、高精准、可同时提供单倍型定相信息等优势，克服了传统技术局限，为罕见病表观遗传诊断及变异解读提供全新解决方案。

三篇文献从不同维度印证了 HiFi 测序的技术革新价值：聚焦难检变异捕获、规模化临床验证、表观遗传检测，全方位突破传统技术瓶颈。HiFi 测序以 “单技术多维度覆盖、高精准度、低覆盖度耐受” 为核心特质，能大幅缩短诊断周期、提升诊断率、简化诊疗流程，减少患者“Diagnostic  Odyssey（诊断奥德赛）” 的痛苦。在国际罕见病日来临之际，HiFi 测序正以技术革新之力，让“罕见”不再“难见”，为全球 3 亿罕见病患者点亮精准诊疗的希望之光。

参考文献：

https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2024.12.013

https://doi.org/10.64898/2026.01.13.26343759

https://doi.org/10.1186/s13073-025-01506-9

基因有限公司作为PacBio公司中国区合作伙伴，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

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