《Functional & Integrative Genomics》：Fusion protein based strategies for developing insect-resistant crops
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这篇综述系统性地探讨了融合蛋白技术在开发抗虫作物中的应用前景，旨在应对全球农业因虫害导致的巨大经济损失。文章深入分析了单基因抗虫策略（如Bt作物）的局限性，如靶谱窄、易产生抗性等，并重点阐述了融合蛋白技术（结合Cry、Vip、Lectins等多种杀虫蛋白）的设计原理、优势（如广谱、延缓抗性、协同作用）及其在多种作物（水稻、玉米、棉花等）中的应用实例，为发展高效、可持续的虫害综合治理(IPM)策略提供了重要的生物技术路径。
在当今全球人口激增和粮食安全压力日增的背景下，作物虫害每年造成高达25-30%的产量损失，是农业可持续发展的重大威胁。传统依赖广谱化学农药的防治模式，因其对生态环境、有益昆虫及人类健康的负面影响，以及导致害虫抗药性快速进化等问题，正面临严峻挑战。因此，开发高效、精准且环境友好的害虫管理新策略，已成为农业生物技术领域的迫切任务。其中，利用植物宿主抗性，特别是通过生物技术手段培育抗虫作物，是病虫害综合治理(IPM)中的核心环节。
单基因抗虫策略的局限与挑战
过去几十年，以苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白（如Cry、Vip蛋白）基因为代表的单基因抗虫技术取得了巨大成功，例如Bt棉花和Bt玉米。这些基因在作物中表达后，产生的杀虫蛋白能在靶标害虫（主要是鳞翅目和鞘翅目）的中肠内被特异性激活，与中肠上皮细胞表面的受体（如氨肽酶N(APN)、碱性磷酸酶(ALP)、ABC转运蛋白等）结合，导致细胞膜穿孔、渗透压失衡，最终杀死害虫。然而，这一策略存在固有缺陷：杀虫谱较窄，对许多刺吸式口器害虫（如飞虱、蚜虫）无效；更为严峻的是，害虫种群在持续的选择压力下，能够通过受体突变或表达量改变等方式，迅速进化出对单一毒素的抗性，这在棉铃虫(Helicoverpa armigera)对Cry1Ac蛋白、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)对Cry1F蛋白的田间抗性案例中已得到证实。
融合蛋白：理性设计、作用机制与工程策略
为克服单基因策略的瓶颈，融合蛋白技术应运而生。融合蛋白是指通过基因工程手段，将两个或多个来源、功能不同的蛋白质编码序列，通过连接肽(Linker)串联，在共同启动子（如常用的花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)）和终止子控制下，表达为单一的多功能多肽分子。这种设计本质上实现了一种“基因叠加”策略，能针对害虫生命周期的多个环节或不同种类的害虫同时起作用，大幅提高了产生抗性的遗传障碍。
融合蛋白的核心策略与优势
融合蛋白的设计蕴含多种核心策略：
- 1.
扩大杀虫谱与增强毒性：将作用于不同害虫或同一害虫不同生理过程的蛋白融合。例如，将主要靶向鳞翅目害虫的Bt Cry1Ac蛋白结构域（特别是负责膜穿孔的结构域I和负责受体识别的结构域II），与能结合半翅目害虫中肠凝集素受体的大蒜凝集素(ASAL)融合。由此产生的Cry1Ac:ASAL融合蛋白，在转基因水稻中能同时有效防治螟虫（鳞翅目）和褐飞虱（半翅目）。
- 2.
提高口服生物利用度与系统递送：许多高效的神经毒素（如蝎毒、蜘蛛毒肽）本身口服毒性低，因为它们难以穿越昆虫肠道屏障进入血淋巴和神经系统。通过将其与能结合昆虫中肠特定糖基、并促进跨膜转运的“载体蛋白”融合，可实现高效的口服递送。常用的载体蛋白包括雪花莲凝集素(GNA)。例如，蜘蛛毒肽ω-ACTX-Hv1a与GNA融合后，能通过取食进入害虫体内并作用于神经系统的钙离子通道，对鳞翅目、双翅目等多种害虫表现出口服毒性。
- 3.
协同作用与延缓抗性：融合两种作用机制不同的Bt蛋白（如Cry1Ab与Vip3A），或与蛋白酶抑制剂（如玉米蛋白酶抑制剂(MPI)）融合，能产生协同增效作用，并使得害虫难以通过单一突变同时抵抗所有作用机制，从而显著延缓抗性的发展。
优化蛋白质选择：功能、稳定性与表达因素
成功的融合蛋白设计需要考虑多方面因素：
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蛋白来源与功能：组分蛋白可来自微生物（如Bt）、植物（如凝集素、蛋白酶抑制剂）或动物（如蝎、蜘蛛的神经毒素）。
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结构域工程：有时仅需融合特定功能结构域而非完整蛋白。例如，在Cry1Ac:ASAL融合中，只使用了Cry1Ac的I、II结构域，删除了可能干扰融合蛋白稳定性的III结构域。
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连接肽设计：连接肽的选择至关重要。柔性连接肽（富含甘氨酸、丝氨酸）允许两个结构域独立运动，适合需要各自独立发挥功能的场景；刚性连接肽（富含脯氨酸）则能固定结构域的相对方位，可能有利于形成具有新功能的协同结构。
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表达系统优化：在植物中，需选择合适的启动子以实现高效、适时适地的表达。除了组成型表达的CaMV35S启动子，还可使用组织特异性（如韧皮部、绿色组织特异性）或诱导型启动子，以降低对作物的代谢负担并减少对非靶标生物的影响。
融合蛋白在害虫治理中的应用实例
融合蛋白技术已在多种作物中展示了其应用潜力：
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基于Bt的融合蛋白作物：表达Cry1Ac:ASAL融合蛋白的转基因水稻，能同时抵抗二化螟、稻纵卷叶螟和褐飞虱。表达Cry1Ab/Vip3A融合蛋白的水稻，对二化螟和稻纵卷叶螟表现出高抗性。通过结构域替换（如用Cry1Gc的结构域III替换Cry1Ab的结构域III）构建的嵌合蛋白Cry1Ab-1Gc，在转基因水稻和玉米中均展现出对螟虫的增强抗性。
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凝集素作为载体的融合蛋白：GNA被广泛用作载体，递送昆虫神经肽、蝎毒或蜘蛛毒肽。例如，GNA与昆虫生长调节神经肽Manse-AS融合后饲喂番茄夜蛾幼虫，能显著抑制其取食和生长。
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蝎毒为基础的融合蛋白：来自南非红蝎(Mesobuthus tamulus)的ButaIT毒素与GNA融合形成的ButaIT/GNA蛋白，注射或饲喂能对多种害虫（鳞翅目、双翅目幼虫）产生急性和慢性毒性。来自北非蝎(Androctonus australis)的AaIT毒素与GNA融合形成的AaIT/GNA蛋白，在转基因烟草、拟南芥和水稻中表达后，能同时增强对咀嚼式口器害虫（棉铃虫）和刺吸式口器害虫（烟粉虱、褐飞虱）的抗性。
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蜘蛛毒肽为基础的融合蛋白：多种蜘蛛毒肽（如靶向电压门控钠离子通道的PI1a，靶向钙离子通道的Hv1a）与GNA融合后，均显示出显著的口服杀虫活性，且能有效防治对拟除虫菊酯类农药产生抗性的蚜虫品系。
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TAT-PTD-滞育激素基融合蛋白：利用人类免疫缺陷病毒转录反式激活因子(TAT)的蛋白转导结构域(PTD)，能促进融合蛋白（如TAT-滞育激素caDH，TAT-昆虫激肽HezK I）在昆虫体内的跨膜吸收。表达TAT-HezK I与豆豉胰蛋白酶抑制剂(CpTI)融合蛋白的转基因烟草，对棉铃虫的毒性和抗性显著高于单独表达CpTI的植株。
融合蛋白在应对其他作物生产挑战中的潜力
除了抗虫，融合蛋白技术在应对植物病害、线虫及非生物胁迫方面也展现出广阔前景。例如，将两种植物防御素（Tfgd2和RsAFP2）融合并在烟草中表达，能同时提高对真菌病原菌（立枯丝核菌、寄生疫霉）和害虫（斜纹夜蛾）的抗性。在水稻中表达两种蛋白酶抑制剂（MPI和PCI）的融合蛋白，不仅能增强对螟虫的抗性，还能提高对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性。
结论与展望
融合蛋白技术代表了农业生物技术领域一个充满希望的前沿方向。它通过精巧的分子设计，整合了多种杀虫、抗病机制，为解决单一抗性基因的靶谱窄、易失效等问题提供了创新方案。尽管在融合蛋白的稳定性、表达效率、环境安全性评估及监管审批方面仍需深入研究，但其在实现广谱、持久、环境可持续的作物保护方面潜力巨大。随着合成生物学、蛋白质工程和基因编辑技术的进步，未来有望设计出更高效、更智能的融合蛋白，为保障全球粮食安全、推动绿色农业发展贡献关键力量。
