《Cancer Immunology, Immunotherapy》：An innovative treatment for lung cancer using gene-engineered human-induced pluripotent stem cell-derived natural killer cells
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针对晚期实体瘤（尤其是肺癌）现有疗法（包括CAR-T）疗效有限的问题，本研究构建了装载五种基因（CCL19、CCR2B、高亲和力CD16、IL-15、NKG2D-DAP10复合物）的工程化自然杀伤细胞（eNK）。研究证实eNK细胞在体外和体内（包括患者来源异种移植模型）均表现出强大且持久的细胞毒性，单药或与西妥昔单抗联用可显著抑制肿瘤生长，为开发“现货型”异体细胞疗法治疗难治性实体瘤提供了新策略。
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，尤其是晚期患者，现有的化疗、放疗、免疫检查点抑制剂乃至嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法，对于高度异质性的实体瘤效果仍然有限。自然杀伤（NK）细胞因其非人类白细胞抗原（HLA）限制性的杀伤能力和较低的移植物抗宿主病风险，成为极具潜力的替代选择。然而，如何让这些免疫细胞有效地归巢到肿瘤部位、在恶劣的肿瘤微环境中持久存活并保持强大的杀伤能力，是亟待解决的核心难题。
为此，研究人员在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上发表了一项突破性研究，他们利用基因工程技术，对来源于人诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cell, hiPSC）的NK细胞进行改造，创造了一种新型的工程化自然杀伤细胞（engineered natural killer cells, eNK cells）。这些细胞被同时武装了五种关键分子：CCL19（用于招募患者自身的免疫细胞）、CCR2B（增强细胞向表达CCL2的癌细胞迁移）、高亲和力CD16（增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC）、IL-15（促进细胞持久存活与激活）、以及NKG2D-DAP10复合物（提升对癌细胞的识别能力）。这项研究旨在系统评估这种多功能“增强版”eNK细胞在治疗肺癌，特别是难治性肺癌模型中的潜力。
为了开展这项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法：1. 基因工程与细胞培养：构建并培养了装载五种基因的hiPSC来源的eNK细胞。2. 体外功能评估：使用乳酸脱氢酶释放实验和Incucyte活细胞成像系统，评估eNK细胞对多种肺癌细胞系的直接细胞毒性和长期杀伤效果。3. 多种体内肿瘤模型：在免疫缺陷小鼠中建立了细胞系来源异种移植模型和源自真实肺癌患者的患者来源异种移植模型，以模拟临床情况。4. 多种给药途径与药效评估：通过静脉注射和瘤内注射两种方式给药，并利用生物发光成像、肿瘤体积测量等手段评估抗肿瘤效果。5. 机制与药代动力学研究：通过定量聚合酶链反应分析eNK细胞在小鼠体内的分布与持久性，并通过免疫组织化学染色检测肿瘤内人源CD45阳性细胞的浸润情况。
研究结果
eNK细胞的细胞毒性及CD16基因工程改造的体外贡献
体外实验表明，eNK细胞对一系列具有不同基因背景（如EGFR野生型、突变型）的肺癌细胞系均显示出剂量依赖性的强大细胞毒性。更重要的是，eNK细胞与靶向EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗或奈昔木单抗联用时，能通过ADCC效应进一步增强对肿瘤细胞的杀伤，证明了其工程化改造的高亲和力CD16的功能有效性。
瘤内注射eNK细胞对皮下移植的肺癌细胞系H1975-Luc的抗肿瘤作用
在皮下移植的H1975-Luc肿瘤模型中，通过瘤内注射途径给予eNK细胞，能显著且剂量依赖性地抑制肿瘤生长，验证了局部给药的直接抗肿瘤效果。5 H1975-Luc tumor cells (day 0). eNK cells at indicated dose were intratumorally administered three times a week for 2 weeks from day 14. Data are shown as mean ± SD. For all groups, n = 5 except at those times marked “a” (n = 4). Arrows depict the day of eNK cells administration. ; p < 0.01,*; p < 0.001 vs control (vehicle) (Dunnett multiple comparison test)">
eNK细胞在肺癌患者来源的PDX小鼠模型中的作用
在更能模拟临床肿瘤异质性和耐药性的患者来源异种移植模型中，eNK细胞单药治疗可使肿瘤体积减少28%。当与西妥昔单抗联合使用时，肿瘤生长抑制率提升至53%，显示出显著的协同增强效应。免疫组化分析证实，在治疗结束16天后，eNK治疗组肿瘤内部仍可检测到成簇的人CD45阳性细胞，表明输入的人源细胞能够在肿瘤微环境中长期驻留。3, the mice were randomized (day 0). Arrows depict the day of eNK cells administration. c EGFR expression of tumor tissues in J-PDX_E0050-bearing NOG mice. d eNK cells (red arrows) and Cmab (black arrows) were administered three times a week for 3 weeks from day 0 and day 1, respectively. Data are shown as mean ± SD. For all groups, n = 5 except where the number of animals is indicated in parenthesis. *; p < 0.05 vs control (vehicle) (Student t test) PDX, patient-derived xenograft; NOG, NOD/Shi-scid IL-2R gamma (null); EGFR, epidermal growth factor receptor; Cmab, cetuximab. e Representative whole-slide images of immunohistochemistry for human CD45 in tumors harvested on Day 35 (16 days after the last administration). Sections were stained with anti-human CD45 antibody (clone D9M81, Cell Signaling Technology). Whole-slide images were acquired using a Hamamatsu NanoZoomer digital slide scanner (Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japan). Boxes indicate the regions shown at higher magnification. Scale bars, 2.5 mm (upper panels) and 100 μm (lower panels)">
eNK细胞在正常NOG小鼠中的持久性
药代动力学研究显示，静脉注射后，eNK细胞能有效分布到肺部、肝脏和脾脏，并在肺部有较高蓄积。其数量在给药后24小时达到峰值，一周后有所下降，但在第14和28天再次回升，表明eNK细胞在体内具有独特的扩增或再分布动力学，这可能为其持久的抗肿瘤效果提供了基础。6 cells were injected intravenously into male and female NOG mice (Day 0). On days 1, 7, 14, and 28, blood and organs were collected and the DNA content of eNK cells was determined by a human-specific Alu sequence qPCR assay. Panels show the concentration profile of eNK cells in blood (a), lungs (b), liver (c), and spleen (d). Lower limit of quantification (LLOQ): 0.12 pg of DNA from eNK cells/10 or 100 ng of gDNA. Data are shown as mean ± SD (n = 3 mice). NOG, NOD/Shi-scid IL-2R gamma (null)">
静脉注射eNK细胞对原位移植的肺癌细胞系H1975-Luc的抗肿瘤作用
在更贴近临床转移情况的肺癌原位移植模型中，系统性静脉注射eNK细胞同样显示出强大的治疗效果。在高剂量组，甚至观察到了接近完全的肿瘤消退，生物发光信号恢复到基线水平。5 H1975-Luc tumor cells (day 0). eNK cells at indicated dose were intravenously administered three times a week for 2 weeks from day 14. Tumor growth was measured by IVIS luminescence intensity. Arrows depict the day of eNK cells administration. Data are shown as mean ± SD. For all groups, n = 6 except the IVIS control (background) (n = 2). c At the start of administration 2 weeks after H1975-Luc transplantation, it was confirmed that lung cancer cells had taken root in the lungs (arrows), and therapeutic administration was started. Photographs show H&E stained cells (upper) and Ki67 immunostained cells (lower) in a serial section. Scale bar indicates 100 μm. NOG, NOD/Shi-scid IL-2R gamma (null)">
奈昔木单抗介导的ADCC增强eNK细胞在A549-Luc肺癌原位移植模型小鼠中的抗肿瘤作用
在EGFR野生型的A549-Luc原位模型中，eNK细胞与奈昔木单抗联用产生了比任一单药治疗更显著的抗肿瘤效果，进一步证实了通过ADCC效应进行联合治疗的策略具有广阔前景。5 A549-Luc tumor cells (day 0). eNK cells at a dose of 5 × 106cells/mouse were intravenously administered three times a week for 2 weeks from day 4. Nmab at a dose of 0.08 mg/body was intraperitoneally administered twice a week for 2 weeks from day 4. Arrows depict the day of eNK cells (red) and Nmab (blue) administration. A549-Luc tumor growth was measured by IVIS luminescence intensity. Data are shown as mean ± SD. For all groups, n = 5. **; p < 0.01 vs control (vehicle) (Dunnett multiple comparison test). ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity; NOG, NOD/Shi-scid IL-2R gamma (null); Nmab, necitumumab">
结论与讨论
本研究系统论证了经过五种基因改造的eNK细胞作为一种新型“现货型”异体细胞疗法，在治疗难治性肺癌等实体瘤方面的巨大潜力。eNK细胞通过CCL19/CCR2B轴增强肿瘤归巢与免疫细胞招募，通过IL-15和NKG2D-DAP10增强持久性与癌细胞识别，并通过高亲和力CD16有效利用ADCC效应。这些改造使其在体外对多种肺癌细胞系展现出强大且持久的杀伤力，在体内不同模型中（包括更具临床预测价值的PDX模型）均能有效抑制甚至清除肿瘤。
研究结果强调，尽管eNK单药在PDX模型中疗效有限（28%抑制率），但与西妥昔单抗或奈昔木单抗等抗体药物联用，可通过ADCC效应将疗效显著提升（53%抑制率），这为临床联合用药策略提供了坚实依据。此外，eNK细胞在体内的独特药代动力学特征（尤其在肺部的富集）以及治疗后长期在肿瘤内的驻留，为其疗效的持续性提供了支持。安全性初步研究也显示，eNK细胞在长期观察中未引发显著的毒理学问题。
总之，这项研究不仅为克服现有细胞疗法在实体瘤治疗中的瓶颈（如归巢难、持久性差、肿瘤异质性）提供了创新的解决方案，也展示了基于iPSC的“现货型”细胞疗法与现有抗体药物联用的广阔前景，为开发下一代肺癌免疫疗法指明了新方向。未来的研究将集中于优化给药方案、探索更多联合治疗策略，并进一步验证其在其他难治性实体瘤中的应用。
