基于磷酸盐介导的CRISPR/Cas12a调控机制的高度敏感的封闭管碱性磷酸酶检测方法

《Biosensors and Bioelectronics》：Highly sensitive closed-tube detection of alkaline phosphatase based on phosphate-mediated CRISPR/Cas12a regulation

本研究发现磷酸基团对CRISPR/Cas12a的抑制具有显著位点和双磷酸增强效应，据此开发出高灵敏度ALP生物传感器，采用封闭管式系统CASL实现人血清检测，为POC诊断提供新方案。

　　

吴亚鹏|吕蓓|周睿|张赫然|李大伟

中国南方可持续林业协同创新中心，国家林业和草原管理局亚热带森林生物多样性保护重点实验室，南京林业大学生命科学学院，南京210037，中国

摘要

最近，我们发现分裂激活剂交界处的5'-末端磷酸基团会抑制Cas12a的切割活性。在这项研究中，我们发现磷酸介导的Cas12a抑制作用具有两个关键特征：强烈的位置依赖性和显著的双磷酸增强效应。AlphaFold 3（AF3）结构预测表明，这种抑制作用是通过磷酸基团与Cas12a上特定局部残基之间的相互作用来实现的。基于这些发现，我们利用ALP通过去磷酸化激活剂来调控Cas12a的原理，开发了一种高灵敏度的碱性磷酸酶（ALP）生物传感器。该生物传感器无需上游信号放大，就能在7.5 × 10^-6至2.5 × 10^-2 U/L的宽广动态范围内实现对ALP的高灵敏度检测（灵敏度为6.07 × 10^-6 U/L）。此外，该检测方法还可用于评估ALP抑制剂。值得注意的是，我们开发了一种使用脂质体的封闭管检测系统（CASL）。配备CASL的生物传感器能够在人体血清中进行封闭管ALP检测，有效防止环境污染和干扰。由于其简单的封闭管操作流程和优异的性能，这种生物传感器在即时临床诊断中具有巨大潜力。除了其应用价值外，本文揭示的磷酸介导的CRISPR/Cas12a调控机制也为未来的生物传感器设计提供了新的思路。

引言

CRISPR/Cas12a系统作为一种强大的分子诊断工具，凭借其可编程的crRNA引导特异性和强大的切割活性而受到重视（Gootenberg等人2018；Li等人2018；Zhao等人2021）。通过将全长激活剂分割成两个较短的单链DNA片段，可以实现高效且协同的Cas12a激活（Huang等人2024；Li等人2023）。这一设计的一个关键特点是单个片段不具备独立活性，这本质上提高了检测的特异性（Xu等人2024）。利用这种协同激活原理，已经开发出多种生物传感平台，实现了精确的SNV识别（Li等人2023）、AND门逻辑运算（Hu等人2024；Li等人2023）以及直接的RNA响应检测（Rananaware等人2023）。在分裂激活剂中加入一个可编程开关，可以抑制Cas12a的切割活性，直到其被特定酶切触发激活（Hu等人2024；Li等人2025；Yin等人2025）。这种可控机制为多功能生物传感器的设计铺平了道路。

化学修饰，包括磷酸化和乙酰化，是调控蛋白质活性的基本机制。例如，为了应对宿主的CRISPR免疫系统，噬菌体进化出了基于乙酰转移酶的抗CRISPR（Acr）系统来使Cas核酸酶失活（Dong等人2019）。另一方面，我们最近发现激活剂片段交界处的5'-末端磷酸基团会抑制Cas12a的切割活性，而去磷酸化则能使其完全恢复活性（Wu等人2025）。由于末端磷酸基团会在三元复合物（DNA/crRNA/Cas12a）内部引入额外的负电荷，我们推测这种局部微环境的改变可能是Cas12a失活的原因。这些发现为独立于蛋白质磷酸化的Cas12a活性提供了新的可编程调控策略。

碱性磷酸酶（ALP）作为一种关键的磷酸水解酶，在各种组织和生物体中广泛存在，它通过去磷酸化参与关键的代谢过程（Bilski等人2017；Rader 2017；Schini等人2023）。ALP水平的异常变化是多种病理状态的标志，包括低磷酸酯酶症、肝胆疾病、骨骼疾病和前列腺癌（Moura等人2022；Niu等人2019；Shaban等人2022）。该酶也存在于唾液中，与口腔疾病有关，并且在尿液中的水平与血清中的水平相当（Amador等人1963）。因此，对这些生物流体中ALP的可靠定量对于诊断至关重要。

基于对硝基苯磷酸（pNPP）水解的标准比色法ALP检测方法虽然简单，但对低浓度样本的灵敏度较低（Bessey等人1946）。尽管电化学方法和表面增强拉曼散射（SERS）方法具有更高的灵敏度，但它们需要复杂的仪器和操作技能，主要限于中心实验室使用（Ingram等人2009；Mahato等人2020）。将CRISPR技术应用于ALP检测，可以实现新型的、适用于现场检测的即时诊断方案。例如，通过去除引物上的5'-末端磷酸基团来启动ALP检测，从而触发等温扩增，生成Cas12a激活剂，最终切割报告基因探针（Zhuo等人2024）。此外，ALP介导的去磷酸化可以阻止λ外切核酸酶对DNA的降解。这一过程可以用于生成CRISPR/Cas13a的RNA激活剂（Wang等人2021），或者通过toehold介导的DNA组装生成CRISPR/Cas12a的DNA激活剂（Wang等人2025）。另外，ALP对焦磷酸的水解会释放Cu²⁺，触发一系列反应，使离子激活的DNA酶切割底物，产生功能性的CRISPR/Cas12a DNA激活剂（Lai等人2022）。然而，这些策略中Cas蛋白的间接激活需要中间的信号转导和放大步骤，这些步骤容易受到内在噪声的影响，从而限制了可实现的灵敏度和特异性。鉴于CRISPR/Cas12a的强大扩增能力，ALP对其的直接和精确调控可以实现背景更低、灵敏度更高、特异性更好的检测。

在这项研究中，我们系统地研究了末端磷酸基团对CRISPR/Cas12a的抑制作用，重点关注它们在激活剂片段中的位置和累积效应。结合荧光淬灭结合检测和AlphaFold预测的三元复合物（Cas12a/crRNA/激活剂）结构（Abramson等人2024），我们对末端磷酸基团抑制Cas12a的机制有了初步了解。基于这些发现，我们开发了一种高灵敏度的ALP生物传感器，其中目标物质可以直接激活CRISPR/Cas12a，无需任何上游信号转换器。为了消除环境污染和干扰的风险，我们开发了一种使用脂质体的封闭管检测系统（CASL），并将其应用于ALP生物传感器中以检测人体血清样本。该系统表现出稳健的性能，表明这种方法在即时诊断（POC）中具有潜力。

材料

核苷酸序列列于表S1中。本研究中使用的详细材料见支持信息。

LbCas12a的表达与纯化

LbCas12a的表达和纯化按照我们之前报道的方法进行（Wu等人2025）。相关方法的详细信息见支持信息。

实时荧光测定

详细的实验步骤见支持信息。

基于荧光淬灭的结合检测

详细的实验步骤见支持信息。

ALP的检测

反应混合物（4 μL）

末端磷酸基团对CRISPR/Cas12a活性的位置依赖性抑制

最近，我们发现分裂激活剂交界处的5'-末端磷酸基团会抑制Cas12a的活性（Wu等人2025）。这些发现提供了一种基于激活剂磷酸化的新策略，而非蛋白质磷酸化来调控Cas12a活性。然而，这种抑制作用是否仅限于分裂激活剂及其位置依赖性尚不清楚。

在本研究中，首先考察了单个激活剂激活Cas12a的活性，无论是否添加其他成分

结论

总结来说，我们的研究表明，分裂激活剂中的末端磷酸基团对CRISPR/Cas12a的抑制作用具有两个主要特征：明显的磷酸位置依赖性和双磷酸增强效应。荧光淬灭检测和AF3结构预测的综合证据表明，这种抑制作用是通过磷酸基团与Cas12a上特定局部残基之间的相互作用来实现的。基于这些发现，我们开发了一种高灵敏度的ALP检测方法

CRediT作者贡献声明

周睿：写作 – 审稿与编辑，方法学。张赫然：方法学。李大伟：写作 – 初稿撰写，监督，概念设计。吴亚鹏：方法学，研究，概念设计。吕蓓：写作 – 审稿与编辑，资金获取，概念设计

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：22307047）和江苏省的青兰计划的支持。