CRISPR/Cas9介导的lgp2基因敲除及跨物种挽救实验揭示了LGP2在斑马鱼中的免疫调节作用

《Fish & Shellfish Immunology》：CRISPR/Cas9-mediated lgp2 knockout and cross-species rescue reveal the immunoregulatory role of LGP2 in zebrafish

CRISPR/Cas9构建zebrafish lgp2敲除模型，发现基础免疫状态下lgp2调控RLR通路基因表达及干扰素应答，转录组分析揭示3186个差异基因，其中claudin家族基因显著上调。蛋白互作显示irf7与claudin b存在相互作用，进化分析表明lgp2关键结构域（DEXDc、HELICc、CTD）在鱼类中保守但序列差异显著。跨物种拯救实验证实zebrafish lgp2对irf7诱导特异性调控，为解析免疫稳态调控机制及物种适应性进化提供新证据。

　　

廖一健|李耀国|李一琳

湖南农业大学渔业学院，长沙，410128，中国

摘要

LGP2是RIG-I样受体（RLR）通路中的关键调节因子，在抗病毒免疫中具有双重作用，但其基础状态下的功能及其在鱼类物种间的进化变异仍需进一步研究。在本研究中，我们使用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼lgp2基因敲除模型。lgp2基因敲除导致关键的RLR信号成分（mda5、mavs）、I型干扰素（ifnphi1、ifnphi3、ifnphi4）以及干扰素刺激基因mxa的表达上调。对3天大的胚胎进行转录组分析，鉴定出3,186个差异表达基因（DEGs），其中包括五个claudin家族基因的表达显著升高。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析表明irf7和claudin b在蛋白质水平上存在相互作用。基因本体分析显示，LGP2在螺旋酶活性和ATP酶活性等术语中富集，并且在细胞外结构术语中也显著富集。比较序列分析发现，斑马鱼、草鱼和刺鳅的LGP2具有保守的DEXDc、HELICc和CTD结构域，但也存在显著的物种特异性序列变异。功能拯救实验表明，所有三种LGP2同源物都能在lgp2-/-胚胎中恢复lgp2的表达并调节下游干扰素反应；然而，只有斑马鱼来源的LGP2能够特异性诱导转录因子irf7的表达。这些结果为理解LGP2在硬骨鱼类免疫中的功能多样性提供了见解，并为旨在提高疾病抵抗力的选择性育种策略提供了依据。

引言

病原体通过先天免疫系统中的模式识别受体（PRRs）被检测到，这是宿主抵御病原体入侵的第一道防线。其核心机制在于PRRs识别病原体相关分子模式（PAMPs）[1]。在多种PRRs中，位于细胞质中并作为关键病毒RNA传感器的RIG-I样受体（RLRs）在启动抗病毒干扰素反应中起核心作用[2]、[3]、[4]。然而，这个家族的一个成员——实验室遗传学和生理学2（LGP2）——自发现以来一直存在争议，并成为研究的焦点，主要是因为它缺乏信号转导所必需的CARD结构域[5]、[6]。在鱼类中的广泛研究表明，LGP2在RLR介导的抗病毒免疫反应中具有双重调节作用。例如，黑鲤的LGP2被证明可以抑制RIG-I介导的干扰素信号传导[7]，而在感染鲤病毒性春热病（SVCV）的普通鲤中，LGP2显著增强了MDA5介导的I型干扰素表达，从而抑制病毒复制[8]。这些发现突显了LGP2功能调节机制的复杂性。最近一项关于斑马鱼的研究提出了“功能切换”假说，认为LGP2不是一个简单的单向调节因子，而是一个动态的“免疫稳态调节器”：在早期感染或低强度刺激下，它通过增强MDA5信号传导来积极启动干扰素反应；而在晚期感染或高强度刺激下，它转变为负向调节模式，通过靶向并抑制TBK1/IKKi等信号分子的mRNA来防止过度产生干扰素引起的免疫病理损伤[6]、[9]。这一模型为统一LGP2的双重作用提供了关键框架。

尽管“功能切换”模型取得了显著进展，但目前的研究仍存在明显空白。首先，现有知识主要依赖于特定的病毒挑战模型[8]、[10]，而LGP2在无病原体感染的基础生理条件下对宿主整体免疫网络和全局基因表达谱的影响仍是一个未探索的领域。理解这种基础状态下的调节机制是阐明其在免疫稳态中功能的前提。其次，研究表明，硬骨鱼类的RLR系统在进化过程中经历了广泛的多样化，包括基因丢失、重复和剪接变异[11]、[12]、[13]、[14]。这表明不同物种之间的LGP2序列和功能可能存在差异。然而，目前缺乏关于不同鱼类物种中LGP2蛋白关键功能域的自然序列变异如何定量影响其调节效能和特异性的系统比较分析和直接功能验证。

因此，本研究首先利用CRISPR/Cas9技术建立了斑马鱼lgp2基因敲除模型。通过对3天大的胚胎进行RNA-seq转录组分析，我们系统地揭示了LGP2缺失在基础发育条件下引起的全局转录组变化。我们从系统层面评估了其在维持免疫稳态中的作用。此外，我们克隆并比较了斑马鱼、草鱼和刺鳅的lgp2编码序列，重点分析了它们的关键结构域（包括DEXDc、HELICc和负责RNA识别的CTD）的保守性和差异性。最后，我们设计并进行了跨物种基因拯救实验，在lgp2敲除的斑马鱼中表达不同来源的LGP2，直接比较它们恢复下游干扰素和干扰素刺激基因（如mxa）正常表达水平的能力。这些功能互补实验旨在从进化生理学的角度提供关于LGP2蛋白功能保守性和潜在适应性变异的直接实证证据。本研究旨在阐明LGP2在鱼类中维持先天免疫稳态的具体机制，并尝试提供关于免疫相关基因在进化过程中功能权衡和适应的新视角。

实验部分

实验方法

斑马鱼饲养

本实验使用的野生型AB品系斑马鱼由南京新佳医药科技有限公司提供。实验期间，所有斑马鱼均生活在循环过滤水中，水温维持在27.5-28.5°C，pH值在6.8到7.5之间，实行14:10的光照-黑暗周期。

使用CRISPR/Cas9系统生成lgp2基因敲除斑马鱼

从

建立lgp2基因敲除斑马鱼

以AB品系斑马鱼为背景，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，经过三代筛选和鉴定后成功构建了lgp2基因敲除（lgp2-/-）斑马鱼模型。测序结果显示，设计的sgRNA靶向位点位于lgp2基因的第5外显子，导致目标位点发生6个碱基对的缺失和1个碱基对的插入（图1A）。这一突变导致LGP2编码区发生移码。

讨论

作为RIG-I样受体（RLR）家族中唯一缺乏信号转导所必需的CARD结构域的成员，LGP2在抗病毒先天免疫中的功能长期以来被认为是一个复杂且矛盾的调节节点。通过构建斑马鱼lgp2基因敲除模型并结合转录组分析和跨物种拯救实验，本研究揭示了LGP2在基础免疫稳态中的核心调节作用。

伦理声明

本研究涉及斑马鱼的所有实验程序均经过湖南农业大学（长沙）伦理委员会的审查和批准，并严格遵循相关国家法规和机构伦理指南进行。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

数据可根据请求提供。

作者声明

廖一健：进行实验和生化分析，分析数据，并撰写初稿；负责研究构思和设计、实验和生化分析，以及手稿撰写和资金获取。

李耀国：参与研究构思和设计，进行实验和生化分析，提供手稿撰写指导。

李一琳：参与研究构思和设计，制定手稿的整体框架，并撰写初稿。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32573501、32172966）、湖南省自然科学基金（2024JJ5199）、湖南省教育厅科学研究基金（23A0183）以及湖南省科技创新计划（2025RC3170）的支持。