在开发基因诊断制剂时，利用生物技术方法构建内部控制样本

《Molecular Genetics, Microbiology and Virology》：Biotechnological Approaches to the Construction of an Internal Control Sample when Developing Gene Diagnostic Preparations

分析基因诊断试剂中内部对照样本（ICS）的生物技术构建方法，采用人工核酸序列生成技术及质粒载体pAL2-T克隆，验证外源（水母gfp基因）和内源（人类DNA基因）ICS在PCR检测中的有效性，确保霍乱弧菌等高危病原体检测时对照实验的准确性。

　　

摘要

本研究的目的是分析在基因诊断制剂生产过程中构建内控样本（ICS）的生物技术方法，并为俄罗斯抗瘟疫微生物研究所生产的PCR测试系统开发此类ICS。材料与方法。为了创建一种不存在于任何已知生物体中的人工核苷酸序列，使用了在线资源“Random DNA Sequence Generator”。使用DNA-Works软件（v3.2.4）选择了用于生成人工核苷酸序列的特异性引物。寡核苷酸是通过ASM-800自动DNA合成仪采用标准的固相氨基磷酸酯法合成的。作为ICS使用的扩增产物被克隆到pAL2-T载体中。细菌培养和菌株筛选是在含有50 μg/mL氨苄西林作为选择因子的Luria-Bertani（LB）琼脂培养基上进行的。结果。本文介绍了构建ICS的生物技术方法。在第一种情况下，选择了水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白基因sGFP-206（gfp）的174 bp区域来创建外源性ICS，因为几乎可以排除该序列存在于研究样本中的可能性。在第二种情况下，创建了一种不存在于任何已知生物体中的人工核苷酸序列。在开发用于通过PCR结合荧光检测方法来检测研究临床样本中V. cholerae菌株DNA的诊断试剂盒时，其中一个任务是构建内源性内控样本。建议使用人类DNA基因作为ICS的DNA靶标。根据所生产测试系统的工作协议，进行了研究以评估在49、58和60°C的引物退火温度下ICS片段的扩增效率，并确认这不会对目标基因片段的扩增反应效率产生负面影响。结论。所采用的方法使得能够创建三种类型的ISO，以便利用RT-PCR技术对所生产的试剂盒进行质量控制，从而识别出诸如霍乱、瘟疫、炭疽、布鲁氏菌病和兔热病等特别危险传染病的病原体DNA，并通过荧光检测方法记录结果。