“Target capture”方法有效解决了Diachrysia蛾类长期以来在分类学上的难题（即这一类昆虫在分类学研究中的停滞状态）

《Systematic Entomology》：Target capture efficiently resolves the long-standing taxonomic dead end of Diachrysia moths

　　摘要

准确的物种界定和鉴定对于评估生物多样性和保护物种至关重要。Diachrysia cryptic蛾复合体包括D. chrysitis和D. stenochrysis，它们具有重叠的形态特征，这使得物种鉴定变得复杂，并使得它们是否为独立物种存在争议。我们采用了一种基于1753个核单拷贝同源基因的目标富集方法来澄清它们的关系，并测试这种方法在解决复杂分类问题上的有效性。系统发育和种群结构分析显示这两个分类单元之间存在明显的核基因差异，这与每个物种内部观察到的翅型变异形成对比。我们还发现了一些罕见的情况，即线粒体DNA条形码区域（COI）在两个物种之间是共享的。这种遗传变异与形态变异之间的不一致表明，仅凭翅型往往无法可靠地诊断物种。我们的研究加深了对Diachrysia的进化和物种形成历史的理解，并为解决最近分化的姐妹分类单元的复杂分类问题提供了一个有效的基因组模型。

引言

物种是生命的基本实体。它们是随着时间推移而多样化以及谱系不可逆分裂成独立物种的结果。这一过程被称为物种形成。物种也是生命中最显而易见且最容易识别的元素，由于它们代表了生物多样性分类的关键单元，因此精确的物种鉴定是所有生物多样性研究（包括生物多样性保护（Sutherland等人，2015年）和生态监测（Austen等人，2016年）的先决条件。例如，理解食物网（Creer等人，2016年）或种群动态模式（Fitzpatrick等人，2009年）、评估生态系统健康状况（Cardinale等人，2012年）以及预测灭绝事件（Pimm等人，2014年）都依赖于我们对物种多样性的全面了解。这种知识对于做出有关生物多样性保护的明智决策以及减轻生物多样性丧失的影响（Mace等人，2012年）至关重要。然而，精确的物种鉴定依赖于精确的物种界定（Pyron等人，2026年）。物种的界定往往并不简单。物种形成是一个缓慢的过程，有时分化谱系之间的界限仍然模糊不清，导致物种划分具有任意性（Ivanov等人，2023年；Joshi等人，2024年；Lam等人，2024年）。隐秘多样性为界定物种边界和鉴定标本到特定物种带来了另一个重大障碍（Chornelia等人，2022年；Miglietta & Pruski，2023年；Struck等人，2018年）。这些障碍反过来又阻碍了生物多样性保护和生物监测工作（Sales等人，2018年）。物种形成的模式，受到地理环境（如异域性、同域性或邻域性）的影响，可能导致隐秘物种的出现以及物种内部的形态变异，这取决于进化压力和孤立种群中的遗传分化（Bickford等人，2007年；Mehner等人，2021年）。当生殖隔离与遗传分化同时发生但缺乏相应的形态分化时，就会产生隐秘物种。相比之下，在许多孤立种群中，形态差异更为明显，这通常是由于适应不同环境或基因漂变所致（Termignoni-Garcia等人，2022年）。与通常繁琐的形态评估相比，基因组方法具有提高物种界定效率、客观性、标准化程度、速度和成本的潜力（Eberle等人，2020年；Joshi等人，2024年）。同时，基因组见解提供了对研究组基因流水平、基因渗入和系统发育结构的更精确理解，从而改进了相关标准和技术（Dzhembekova等人，2020年；Voet等人，2022年）。夜蛾Diachrysia chrysitis（Linnaeus）和D. stenochrysis（Warren）的情况是鳞翅目分类学中的一个长期存在的问题。Diachrysia chrysitis广泛分布于欧洲，并向东延伸至高加索地区、俄罗斯远东、西伯利亚、阿穆尔地区和日本，其南部范围到达西班牙南部、意大利南部和巴尔干半岛。据认为它不存在于希腊群岛（图1）（Goater等人，2003年）。相比之下，D. stenochrysis的分布范围更广，遍布欧洲和高加索地区，并延伸至俄罗斯远东，包括滨海边疆区、乌苏里、满洲、蒙古、外贝加尔地区、韩国和日本（图1）（Goater等人，2003年）。这两个分类单元的分布范围有相当大的重叠。由于D. stenochrysis和D. tutti据推测是同一物种的东部分布和西部分布代表（Goater等人，2003年；Hammond，2022年），本文将这两个名称视为同义词，并使用较旧的名称D. stenochrysis。

图1：基于经过验证的GBIF记录的Diachrysia chrysitis（上）和D. stenochrysis（下）的地理分布。点代表用于生成分布图的记录，显示了这两个物种在欧洲和北亚的主要古北界分布。Diachrysia chrysitis和D. stenochrysis具有重叠的形态特征，使得它们在视觉上难以区分。Kostrowicki（1961年）是第一个将这两个物种区分开来的学者。他根据某些外部特征（如前翅的金属光泽带和雄性生殖器）的不同，提出“tutti”与D. chrysitis不同（Goater等人，2003年）。这两个物种的翼展均为34-40毫米，头部和胸部呈灰褐色，额部为橙色，腹节为姜黄色。它们的前翅呈金色至绿色金属光泽，尽管D. chrysitis的非金属中间带通常是完整的，而在D. stenochrysis中则通常是断裂的（Goater等人，2003年；Hammond，2022年）。据报道，它们的生殖器也存在细微差异（Goater等人，2003年）。D. chrysitis的瓣膜较长且较窄，具有一个大的圆形背基突起和一个小的圆形腹基突起。相比之下，D. stenochrysis的瓣膜较宽，壶腹较长，突起更呈卵形（Hammond，2022年）。这两个分类单元的幼虫毛序和形态也有所不同（Ahola & Silvonen，2005年）。尽管它们在形态上有很大的重叠，但这些结构提供了区分它们的依据。多年来，多位学者基于外部和生殖器形态研究了D. stenochrysis是否为一个独立物种（Goater等人，2003年；Lempke，1965年；Svensson等人，1989年；Veps?l?inen & J?rvinen，1979年）。虽然Urbahn（1967年）和Lempke（1965年）无法通过生殖器形态学研究区分这两个分类单元，但其他人根据鳞片和雄性生殖器等形态结构（Bruun，1987年；Rezbanyai-Reser，1985年）以及信息素差异（L?fstedt等人，1994年；Priesner，1985年；Rezbanyai-Reser，1985年）和同工酶分析（Svensson等人，1989年）认为它们是不同的物种。Hille等人（2005年）首次使用mtDNA将它们区分开来。尽管进行了所有这些研究，但由于D. chrysitis和D. stenochrysis在形态特征、地理分布和遗传谱型上的显著重叠，尚未就其物种界定达成共识（Hammond，2022年）。虽然之前曾使用mtDNA来区分D. chrysitis和D. stenochrysis（Hille等人，2005年），但众所周知，当涉及非常年轻的物种时，mtDNA存在局限性，因为它们可能具有相同或非常相似的mtDNA（Dinc?等人，2021年；Hausmann等人，2013年；Rubinoff等人，2006年）。因此，结合使用大量标准化核标记和mtDNA可以帮助更好地理解这两个物种之间的分类和生物学关系，并减轻仅依赖线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）的局限性（Eberle等人，2020年）。我们利用基因组数据研究了D. chrysitis和D. stenochrysis的分类关系。我们使用了大量通过目标富集方法获得的标准化核标记（Dietz等人，2022年；Joshi等人，2022年；Mayer等人，2021年）来确定D. chrysitis和D. stenochrysis是一个可变物种还是两个独立的、生殖隔离的物种。我们还检查了这两个分类单元之间的当前混合程度，并进一步研究了DNA条形码在鉴定这两个物种方面的可靠性。从更广泛的角度来看，我们旨在测试基因组方法与基于形态学和单一DNA标记的方法在解决复杂分类难题方面的效率和优势。

材料与方法

采样

作为本研究的一部分，我们共收集了33个标本，其中10个为Diachrysia chrysitis，11个为D. stenochrysis作为内群分类单元，另外还有4个Syngrapha hochenwarthi（Hochenwarth）、Xestia lorezi（Staudinger）和Xestia speciosa（Hübner）作为外群分类单元。选择这些外群分类单元是为了确定系统发育树的根节点，并且它们来自夜蛾科（Noctuidae）内部。Syngrapha hochenwarthi属于与目标属Diachrysia相同的亚科（Plusiinae），而Xestia物种代表一个更远缘的夜蛾谱系（Noctuinae）。这种组合的选择是为了在最小化外群选择可能带来的偏差的同时，可靠地推断等位基因的方向（祖先型 vs. 衍生型）。内群样本来自芬兰和奥地利，使用信息素陷阱收集，并根据信息素和形态特征进行分类。这些样本现保存在奥卢大学。外群样本来自芬兰、奥地利、瑞士、俄罗斯和加拿大。在芬兰和奥地利，信息素陷阱使用Pherobank（https://www.pherobank.com/）提供的漏斗形陷阱设置。在芬兰，奥卢大学植物园的不同地点使用了四到五个信息素陷阱来收集这两个分类单元的标本。这些陷阱从2019年6月到8月定期检查以收集标本。在奥地利，最西部的福拉尔贝格州和蒂罗尔州，每个信息素设置了两个陷阱，即总共四个陷阱，放置在大约1.5米高的灌木上，彼此之间至少相距10米，并在清晨收集。捕获的标本使用Nexa Lotte?条带杀死。使用的信息素混合物为Z5-10:Ac和Z7-10:Ac，比例为D. chrysitis 100/10 μg，D. stenochrysis 2/100（L?fstedt等人，1994年；Priesner，1985年）。

目标富集文库制备

文库制备遵循Mayer等人（2021年）的方法。简而言之，从固定标本的胸部大约三分之二的部分提取基因组DNA。DNA提取使用QIAGEN DNeasy Blood and Tissue试剂盒按照制造商提供的协议进行。DNA提取物在1.5%琼脂糖中可视化。取500纳克的绝对DNA量进行进一步处理。基因组DNA经过随机机械剪切，平均大小约为150 bp，然后使用bioruptor（Diagennode）进行文库制备。文库制备包括以下步骤：末端修复反应，将腺嘌呤残基连接到 blunt 片段的3′端以便连接条形码适配器，以及文库的PCR扩增。文库构建后，使用Agilent Technologies的SureSelect探针进行基于溶液的目标富集，创建包含8个文库的池，遵循Illumina Paired-End Multiplexed Sequencing Library协议的SureSelectxt Target Enrichment System。富集后，使用Illumina Nextseq 500 mid输出在赫尔辛基大学生命科学研究所的Biomedicum Functional Genomics Unit进行测序，生成配对末端150-bp的读段。

DNA条形码

内群样本D. chrysitis和D. stenochrysis的DNA条形码使用标准程序（Martin，2008年）扩增，纯化后的产物被送往Macrogen Europe进行测序。此外，还使用exonerate版本2.4.0（Slater & Birney，2005年）从目标富集数据集中提取条形码，将成功条形码化的个体作为查询，我们将新组装的目标富集组装作为目标（命令的详细信息见支持信息）。这些提取的条形码使用Geneious Prime? 2023.2.1 Java Version 11.0.18 + 10（64位）进行比对，并在进行系统发育分析之前手动检查。所有新生成的条形码都上传到BOLD数据库。它们的分类和采集细节，包括地理数据和凭证图像，可以通过公共BOLD数据集“Diachrysia chrysitis complex”访问，网址为dx.doi.org/10.5883/DS-DIACHR。

生物信息学分析

首先使用fastqc版本0.12.0对解复用数据进行了质量检查，作为生物信息学流程的第一步。接下来，使用fastp v1.0.1（Chen等人，2018年）去除低质量碱基和适配器序列。为了参考映射，我们使用了Wellcome Sanger研究所提供的D. chrysitis的编码基因序列（cds），这些序列是全基因组测序工作的一部分（Boyes等人，2023年）。为了将这些编码序列分配到同源基因组群中，我们使用了Orthograph（Petersen等人，2017年）工具，并采用了预先定义的基因集，这些基因集是基于五种物种（家蚕Bombyx mori、斑蝶Danaus plexippus、Heliconius melpomene、Melitaea cinxia和Papilio glaucus）的官方基因集（OGS）准备的。生成的核苷酸格式的簇被收集到一个文件中，作为使用bwa 0.7.17版本中的BWA-MEM算法（可从bio-bwa.sourceforge.net获取）对清理后的序列进行映射的参考依据，其中最小种子长度设置为30。成功映射的读段随后从参考映射过程中获得的共识序列中的单个基因比对中提取出来，并通过使用自定义的Perl脚本（Dietz等人，2019年）去除间隙来进一步过滤，以减少缺失数据的数量。过滤后的比对在Geneious Prime版本11.0.18中检查了高GC含量，GC含量超过60%的位点被移除，因为这些位点可能对后续的系统发育分析产生不利影响（Romiguier等人，2010年）。

接下来，使用FASConcat-G v1.06.1（Kück & Longo，2014年）将上一步骤中的过滤比对连接起来。这个连接后的数据集被用作使用IQ-TREE 2.0.3（Minh等人，2020年）构建最大似然树（ML树）的基础。然后，我们采用IQ-TREE的-partitioned分析选项-m TESTMERGEONLY（Chernomor等人，2016年）和rcluster算法（Lanfear等人，2014年）以及rcluster百分比设置为10，在AICc标准下进行分区分析。最佳的分区方案随后被用作IQ-TREE中分区分析的输入。我们应用了1000次重复的超快自举近似方法（Hoang等人，2018年）。此外，为了最小化模型违规的影响，我们使用了-bnni选项。此外，我们还进行了1000次重复的SH类似近似似然比测试（Guindon等人，2010年），并使用了-alrt选项。进行了20次树搜索，log-likelihood最高的树在Figtree中可视化（可在https://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree查看）。通常，包含多个位点的系统基因组数据集由于诸如不完全谱系分选等因素，其基因树之间存在一定程度的一致性差异（Degnan & Rosenberg，2009年）。因此，我们使用了ASTRAL-III v. 5.7.4（Zhang等人，2018年）来推断物种树，因为它在多物种共祖框架下统计上是一致的，并且在推断系统发育时考虑了不完全谱系分选（ILS）。

然后，使用FASConcat-G v1.06.1将上一步骤中的过滤比对连接起来。连接后的数据集被用作使用IQ-TREE 2.0.3构建最大似然树（ML树）的基础。接着，我们使用IQ-TREE的-partitioned分析选项-m TESTMERGEONLY（Chernomor等人，2016年）和rcluster算法（Lanfear等人，2014年）以及rcluster百分比设置为10，在AICc标准下进行了分区分析。最佳的分区方案随后被用作IQ-TREE中分区分析的输入。我们应用了1000次重复的超快自举近似方法（Hoang等人，2018年）。此外，为了最小化模型违规的影响，我们使用了-bnni选项。我们还进行了1000次重复的SH类似近似似然比测试（Guindon等人，2010年），并使用了-alrt选项。进行了20次树搜索，log-likelihood最高的树在Figtree中可视化（可在https://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree查看）。通常，包含多个位点的系统基因组数据集由于诸如不完全谱系分选等因素，其基因树之间存在一定程度的一致性差异（Degnan & Rosenberg，2009年）。因此，我们使用了ASTRAL-III v. 5.7.4（Zhang等人，2018年）来推断物种树，因为它在多物种共祖框架下统计上是一致的，并且在推断系统发育时考虑了不完全谱系分选（ILS）。

从上一步骤中过滤出的比对使用FASConcat-G v1.06.1进行连接。连接后的数据集被用作使用IQ-TREE 2.0.3构建最大似然树（ML树）的基础。然后，我们使用IQ-TREE的-partitioned分析选项-m TESTMERGEONLY（Chernomor等人，2016年）和rcluster算法（Lanfear等人，2014年）以及rcluster百分比设置为10，在AICc标准下进行了分区分析。最佳的分区方案随后被用作IQ-TREE中分区分析的输入。我们应用了1000次重复的超快自举近似方法（Hoang等人，2018年）。此外，为了最小化模型违规的影响，我们使用了-bnni选项。我们还进行了1000次重复的SH类似近似似然比测试（Guindon等人，2010年），并使用了-alrt选项。进行了20次树搜索，log-likelihood最高的树在Figtree中可视化（可在https://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree查看）。通常，包含多个位点的系统基因组数据集由于诸如不完全谱系分选等因素，其基因树之间存在一定程度的一致性差异（Degnan & Rosenberg，2009年）。因此，我们使用了ASTRAL-III v. 5.7.4（Zhang等人，2018年）来推断物种树，因为它在多物种共祖框架下统计上是一致的，并且在推断系统发育时考虑了不完全谱系分选（ILS）。

从上一步骤中过滤出的比对使用FASConcat-G v1.06.1进行连接。连接后的数据集被用作使用IQ-TREE 2.0.3构建最大似然树（ML树）的基础。然后，我们使用IQ-TREE的-partitioned分析选项-m TESTMERGEONLY（Chernomor等人，2016年）和rcluster算法（Lanfear等人，2014年）以及rcluster百分比设置为10，在AICc标准下进行了分区分析。最佳的分区方案随后被用作IQ-TREE中分区分析的输入。我们应用了1000次重复的超快自举近似方法（Hoang等人，2018年）。此外，为了最小化模型违规的影响，我们使用了-bnni选项。我们还进行了1000次重复的SH类似近似似然比测试（Guindon等人，2010年），并使用了-alrt选项。进行了20次树搜索，log-likelihood最高的树在Figtree中可视化（可在https://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree查看）。通常，包含多个位点的系统基因组数据集由于诸如不完全谱系分选等因素，其基因树之间存在一定程度的一致性差异（Degnan & Rosenberg，2009年）。因此，我们使用了ASTRAL-III v. 5.7.4（Zhang等人，2018年）来推断物种树，因为它在多物种共祖框架下统计上是一致的，并且在推断系统发育时考虑了不完全谱系分选（ILS）。

从排序后的BAM文件中识别出单核苷酸多态性（SNPs），其中D. chrysitis的编码DNA序列（CDS）作为参考基因组。这是通过使用samtools v. 1.16.1（Danecek等人，2021年）的mpileup选项结合bcftools的call选项实现的。随后，使用bcftools进行过滤，仅保留双等位基因型SNPs，同时排除插入缺失（indels）和多等位基因型SNPs。然后使用自定义的Perl脚本（https://www.biostars.org/p/313701/，访问日期为2023年11月30日）进一步过滤SNPs，每个位点只保留一个SNP。最终得到的SNPs数量为3123个。

我们使用R v2023.12.1和adegenet（Jombart & Ahmed，2011年）包对SNP数据集进行了主成分分析（PCA）和主成分判别分析（DAPC）。这样做是为了通过降维来检查数据集中的潜在基因簇数量。由于DAPC需要预先识别簇，我们实施了k-means聚类，该算法可以找到最大化簇间变异的簇数量（Jombart & Collins，2015年）。然后使用贝叶斯信息准则（BIC）比较聚类结果，其中最优簇数量由最低的BIC表示。在我们的案例中，使用find.clusters函数确定了最优簇数量为2，根据BIC（最低值）。然后使用dapc函数对这些推断出的簇进行了DAPC分析。我们还使用R包hierfstat（Goudet，2005年）从相同的SNP数据集计算了成对FST。

为了了解可能的簇数量以及混合模式，我们对目标富集SNP数据集进行了STRUCTURE（Pritchard等人，2000年）分析。为了每个位点保留一个SNP，我们使用了未链接的SNPs；为此，我们使用自定义的Perl脚本（https://www.biostars.org/p/313701/，访问日期为2023年8月30日）过滤SNPs。过滤后的SNP数量为3123个。对于分析，假设了五个簇，即K=1到K=5，每个簇进行了10次重复实验。为了在所有10次重复实验中统一簇的分配，我们使用了Clustering Markov Packager Across K或CLUMPAK版本1.1（Kopelman等人，2015年）。为了显示K个群体的条形图，我们使用了Distruct（Rosenberg，2004年）。

我们使用Dsuite（Malinsky等人，2021年）中实现的Patterson的D统计量来评估潜在的历史基因流。使用Dtrios函数计算了所有可能的三重组合的ABBA–BABA统计量和f4比率。计算这个统计量至少需要三个群体——P1、P2和P3——以及一个外群来推断P1和P3或P2和P3之间的过量等位基因共享。由于我们只有两个群体，我们假设每个样本都是一个不同的物种/群体来进行这项分析。除了目标物种外，还包含了3个外群，Syngrapha hochenwarthi、Xestia lorezi和Xestia speciosa，并将它们标记为外群。分析是在VCF格式的SNP数据上进行的；多等位基因位点被自动排除，因为Dsuite只使用双等位基因型SNPs。

Diachrysia chrysitis和D. stenochrysis的出现记录是从全球生物多样性信息设施（GBIF）（访问日期为2026年2月9日）通过GBIF的出现下载获得的（Diachrysia chrysitis的链接为https://doi.org/10.15468/dl.dpd5p6，Diachrysia stenochrysis的链接为https://doi.org/10.15468/dl.pus5ee）。使用R包CoordinateCleaner（Zizka等人，2019年）移除了坐标缺失、海洋出现或潜在地理参考错误（例如，国家中心点或机构坐标）的记录。剩余的记录经过视觉检查，并在生成分布图之前排除了明显的生物地理异常值。

数据集概述

保留的信息核位点的平均数量为627个（标准差SD=140，表S1）。平均缺失数据量为15.32%（标准差SD=0.2470，表S1）。

从线粒体COI和目标富集基因组数据集获得的ML树将两个分类单元分为单系簇，COI ML树的SH-aLRT/UFBoot支持值为90/90，目标富集基因组数据集的两个簇的支持值分别为100/100（图2）。然而，发现来自芬兰的两个D. stenochrysis样本（MM2670和MM26739）与基于信息素分离被分配给D. chrysitis的样本共享条形码（图2）。基因组分析证实了这种线粒体和核基因组的一致性差异。

基于COI DNA条形码（左）和目标富集数据（右）的最大似然系统发育树。D. chrysitis用蓝色表示，D. stenochrysis用橙色表示。分支支持值是使用超快自举（UFBoot）计算的，这是一种计算上更快的非参数自举近似方法，以及SH-aLRT，这是一种SH类似近似似然比测试的实现。使用-bnni选项来减少UFBoot过度估计分支支持的风险。仅显示具有强支持值的节点（SH-aLRT/UFBoot=90/90）。目标富集树恢复了两个得到良好支持的簇，分别对应于这两个物种（SH-aLRT/UFBoot=100/100）。相比之下，条形码树显示两个D. stenochrysis个体聚集在D. chrysitis支系内，表明仅凭COI条形码可能无法始终可靠地区分这两个物种。与ML树类似，D. chrysitis和D. stenochrysis在ASTRAL物种树中也分为两个簇，两个簇的四元组支持值均为1（图3）。标准化四元组得分为0.6。

使用来自Diachrysia chrysitis和D. stenochrysis的目标富集数据集重建的基因树，通过基于共祖方法的ASTRAL推断出物种树。分析总结了来自核单拷贝同源位点的个别基因树之间的一致性差异，以估计物种树。分支支持由四元组支持值表示，这些值代表支持每个分支的基因树四元组的比例；两个物种簇都获得了最大支持（四元组支持=1）。标准化的四元组得分为0.6，反映了基因树与推断出的物种树之间的整体一致性水平，并表明数据集中存在不完全谱系分选（ILS）。所得到的拓扑结构解决了两个得到强支持的支系，分别对应于D. chrysitis和D. stenochrysis。

基于SNP数据集的PCA和DAPC分析都得出了两个遗传上不同的D. chrysitis和D. stenochrysis簇（图4）。第一个主成分解释的变异为8.75%，而PC2的解释变异为8.28%（图4）。

使用STRUCTURE和主成分判别分析（DAPC）从SNP数据推断出群体结构。STRUCTURE条形图显示了每个个体到推断出的遗传簇的比例分配，其中每个垂直条代表一个个体，颜色对应于簇成员概率。DAPC散点图总结了使用主成分后的个体间的遗传变异，并通过判别分析来最大化群体间的分离。两种分析都清楚地显示了Diachrysia chrysitis和D. stenochrysis之间的遗传分离，支持了基于核基因组变异的区分。

成对FST估计表明两个物种之间的遗传分化程度适中（FST=0.20）。使用STRUCTURE进行的基因组混合分析为目标富集SNP数据集得出了K=2簇的最高似然估计（图4）。STRUCTURE的CLUMPAK分析产生的条形图显示了K=2到K=4的簇分配（图4）。结果不表明两个分类单元之间存在混合。

D统计量揭示了多个三重组合之间的显著不对称等位基因共享。共分析了1332个三重组合；其中，230个三重组合显示出高D统计量值（D统计量>0.3；表S2）。从这些三重组合中，我们进一步区分了P1和P2都由D. stenochrysis表示的三组合以及P1和P2由D. chrysitis表示的三组合和P1和P3由D. chrysitis和D. stenochrysis表示的三组合（表S2）。在这些组合中，共有44个三组合的D统计量在统计上显著（p<0.05）。

图5展示了我们Diachrysia样本的翅膀图案变异性，其中两个极端情况能够正确分配物种，而许多样本处于中间状态，显示出翅膀图案的重叠，表明翅膀形态通常不能可靠地指示物种（图5）。金色色调的强度变化主要来自样本状态。

Diachrysia stenochrysis（左）和D. chrysitis（右）的代表性翅膀图案变化。图像展示了每个物种内观察到的前翅图案变化范围，突出了仅基于外部翅膀图案可能难以可靠区分物种的形态特征的重叠。

Diachrysia chrysitis和D. stenochrysis这一对代表了长期未解决的分类难题的典型案例。尽管大多数先前的研究都得出结论认为这两个物种在物种水平上是不同的，但由于用于区分它们的形态特征存在重叠变异性，证据仍然不充分且薄弱。因此，许多中间样本尚未被鉴定。这两个分类单元在广泛的地理区域内是共存的，尽管D. stenochrysis在东部似乎更为常见（Tóth等人，1988年）。在这里，我们基于从1753个单拷贝遗传标记获得的基因组数据，提供了关于这两个Diachrysia进化关系的新见解。在多种分类群中，都存在类似本文研究的、在分类学上存在问题的隐秘物种案例（Bickford等人，2007年）。例如，在研究较为深入的欧洲鳞翅目昆虫中，模糊的分类学物种边界案例数量多达数百个（Mutanen等人，2016年），并且这类案例还在不断被发现，通常表现为物种内部的深度线粒体分化。其中一些案例已经接受了基因组规模的分析（Dinc?等人，2019年；Doorenweerd等人，2023年；Hausmann等人，2021年；Huemer等人，2020年；Kozlov等人，2017年），而我们的研究是首批基于目标捕获方法研究此类案例的研究之一（Khan等人，2023年）。这些方法的优势在于它们基于在不同分类群中广泛存在的单拷贝直系同源基因来界定物种，许多这类基因甚至存在于所有后生动物中。这确保了跨研究的可比性，并减少了由特定谱系标记引入的偏差（Dietz等人，2022年）。我们基于串联和聚合方法的系统基因组分析揭示了两个遗传簇，这两个簇对应于用于吸引样本的两种信息素类型，且通过STRUCTURE分析未发现任何混合的迹象。基于SNP的主成分分析和DAPC分析进一步证实了这一系统基因组学见解，显示出样本强烈地分为两个簇。STRUCTURE分析得出K=2是最可能的遗传簇数量，而CLUMPAK可视化也确认了它们之间不存在混合。多个分析框架（系统基因组学和群体基因组学）的一致性结果强烈支持D. chrysitis和D. stenochrysis代表两个独立且生殖隔离的进化谱系的结论。然而，FST的中等值表明这些分类群可能最近才分化，数据集中存在ILS（不相容性），这一点通过ASTRAL树的标准化四元组得分0.6得到了证实。因此，我们的发现支持根据系统发育物种概念将它们视为不同物种的观点，尽管没有明确测试，但这两个分类群之间可能存在显著的、但不一定是完全的生殖隔离。与核标记观察到的总体模式相反，基于线粒体COI的ML系统发育树显示了线粒体和核基因组之间的不一致性，其中来自芬兰的两个D. stenochrysis样本的DNA条形码与D. chrysitis聚类在一起。虽然这种线粒体和核基因组之间的不一致可能是由于技术因素（如污染）造成的，但在我们的案例中，更可能是由于历史上的基因渗入或不完全的谱系分选（Dinc?等人，2021年）所致。尽管我们不能排除这种观察结果背后存在不完全谱系分选的可能性，但根据D统计量的分析，我们认为观察到的线粒体和核基因组不一致很可能是由于历史上的基因渗入（Dinc?等人，2019年；Khan等人，2023年）。D统计量显示多个三联体之间的等位基因共享存在显著不对称性（p<0.05），表明物种历史并非严格的分支。这种信号在个体间的一致性以及缺乏明显的杂交基因型表明，这些模式更符合历史上的基因流动和/或保留的祖先变异，而不是最近的基因渗入。此外，即使是一次基因渗入事件也可能导致这里观察到的模式，特别是如果是由Wolbachia介导的话（Charlat等人，2009年；Jiggins，2003年；Noguerales & Emerson，2024年）。这反映了mtDNA在解决最近分化或密切相关的分类群分类学问题上的局限性，并突显了基因组规模数据在澄清复杂分类学案例中的力量。这一观察结果也提醒我们在将两个不同的条形码簇视为物种识别的可靠证据时要谨慎。事实上，在这项工作之前，人们普遍认为DNA条形码可以安全地区分Diachrysia物种（Hille等人，2005年）。我们的结果表明，在某些情况下，条形码可能会产生误导。这两个分类群在地理上的重叠，特别是在古北地区，为探索塑造它们分化的历史过程提供了宝贵的背景（Hammond，2022年；Tóth等人，1988年）。目前的共存模式很可能是由于异域分化后范围重叠导致的二次接触，可能受到第四纪气候波动的影响（Dong等人，2020年；Leroy等人，2017年）。基于我们的观察，我们假设特征位移，特别是在信息素通信系统中，可能在两个谱系接触时起到了加强生殖屏障的关键作用。初步的形态学和行为学观察表明，信息素的分化可能是分化的结果而非原因，起到了在二次接触期间防止杂交的作用。共存种群中缺乏基因组混合支持了这一观点，并表明存在强烈的预受精隔离机制（Binks等人，2021年；Yukilevich等人，2018年）。从概念上讲，我们的结果支持这两个分类群在许多物种概念（包括生物学和系统发育物种概念）上是不同的（de Pinna，1999年；Hey，2001年）。我们的基因组数据清楚地证明了互惠单系性，这是系统发育物种概念的标志（Gutiérrez & Garbino，2018年；Mehta & Rosenberg，2019年）。同时，我们的工作表明，单个基因树可能与所有基因树的共识（即物种树）存在偏差（Maddison，1997年；Pamilo & Nei，1988年）。重要的是，我们的发现还突显了物种界定中的一个反复出现的挑战：形态学数据和遗传数据之间的不匹配，即关键形态特征（即翅膀图案）的连续性降低了其在区分物种方面的有效性，除非是在极端情况下（图5）。虽然形态学在大多数情况下仍然有用，但我们的结果表明，在涉及隐秘物种或最近分化的情况下，它可能无法提供足够的洞察力。未来的研究应该探索几个关键领域。首先，已知Wolbachia内共生体会影响生殖隔离和mtDNA模式，因此有必要在这个系统中研究其潜在作用。可以通过广泛的群体水平采样来评估Wolbachia感染状态、菌株多样性和线粒体单倍型之间的关联，以评估Wolbachia对线粒体DNA模式的影响（Jiggins，2003年；Marshall，2004年）。其次，对信息素组成和反应的详细化学和行为分析可以阐明性通信在维持物种边界中的作用（Bacquet等人，2015年；L?fstedt等人，1994年；Yang等人，2015年）。最后，实验性杂交研究将有助于在受控条件下测试生殖屏障的强度和性质。现在能够生成和分析大规模基因组数据为物种界定提供了强大且更客观的框架（Joshi等人，2024年）。与形态学方法或单基因位点方法（如DNA条形码）相比，基因组数据提供了一种定量和可复制的手段来识别物种边界（Zapata & Jiménez，2012年）。鉴于鳞翅目和其他分类群中仍有许多物种复合体尚未解决（Barley等人，2013年；Dinc?等人，2019年），这一点尤为重要。因此，系统地应用基因组方法可以显著加速隐藏生物多样性的命名和识别（Mason等人，2016年；Supple & Shapiro，2018年）。总之，我们的研究对一个复杂分类群中的物种边界进行了全面评估，并展示了基因组工具如何澄清分类学和进化生物学中的长期模糊问题。基因组数据、形态学数据和生态数据的整合为界定物种和理解它们的历史提供了一个稳健的模型，这在面对全球生物多样性丧失的情况下尤为重要。

作者贡献：
Marko Mutanen和Mukta Joshi构思了这项研究并设计了研究项目。Marianne Espeland参与了目标富集试剂盒、分子协议和生物信息学的工作。Marko Mutanen和Mukta Joshi从芬兰收集了用于研究的样本。Peter Huemer从奥地利收集并发送了样本，Nils Ryrholm提供了所使用的信息素。Mukta Joshi进行了实验。Vladislav Ivanov帮助设计了分析并获得了初步结果。Maria Khan分析了数据并起草了手稿。Marko Mutanen监督了整个研究。所有作者都对草稿进行了评论和编辑，并批准了最终版本的手稿。

致谢：
我们感谢Laura T?rm?l?在实验室程序中的协助，以及Mohadeseh Tahami在奥卢协助样本收集的工作。测序服务由赫尔辛基大学生命科学研究所和生物中心的Biomedicum Functional Genomics Unit提供。我们感谢CSC Finland提供了进行生物信息学分析所需的计算资源。最后，我们感谢两位匿名审稿人的建设性评论，这些评论有助于提高手稿的质量。开放获取出版由奥卢大学通过Wiley - FinELib协议促成。

资金信息：
这项研究得到了芬兰研究委员会（Suomen Akatemia）的支持，资助编号为314702，资助对象是Marko Mutanen。Mukta Joshi还想感谢芬兰文化基金会（Suomen Kulttuurirahasto）和奥卢大学奖学金基金会的资助。Maria Khan通过奥卢大学的I4WORLD博士计划获得了资助。

利益冲突声明：
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明：
原始目标富集数据可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/1224050获取，SRA访问号为PRJNA1224050。比对文件、树文件和其他数据可在Zenodo存储库中获取，链接为https://doi.org/10.5281/zenodo.18607030（Khan等人，2026年）。所有分类学和样本收集信息，包括地理数据和凭证图像，以及DNA条形码序列，都可通过BOLD数据集“Taxonomy of the Diachrysia chrysitis complex”公开获取（https://doi.org/10.5883/DS-DIACHR）。本研究中使用的出现记录来自GBIF.org（2026年2月9日访问），通过GBIF的D. chrysitis（https://doi.org/10.15468/dl.dpd5p6）和D. stenochrysis（https://doi.org/10.15468/dl.pus5ee）的下载获取。