一种改进的化学特征分析策略，结合了离线二维逆流色谱技术、超高效液相色谱-质谱（UHPLC–MS/MS）以及基于特征的分子网络分析方法：以Bletilla striata的纤维根为案例，对其进行了全面特征分析

《Journal of Chromatography B》：An enhanced chemical profiling characterization strategy integrating off-line two-dimensional counter-current chromatography × UHPLC–MS/MS and feature-based molecular networking: Comprehensive characterization of the fibrous root of Bletilla striata as a case study

基于2D CCC×UHPLC-MS/MS联用与特征基分子网络分析技术，首次系统解析了白及纤维根的化学组成，鉴定出263个化合物（含15新化合物），较传统1D方法峰容量提升16.7倍，实现80.47%的空间覆盖，显著提升复杂基质中极性成分和异构体的分离能力。

　　

陈培谦|范一雷|马晓霞|李家军|童胜强|楚楚

浙江工业大学药学院，杭州310014，中国

摘要

本研究建立了一个多维分析平台，结合了二维逆流色谱（CCC）×超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）和基于特征的分子网络（FBMN）技术，对Bletilla striata纤维根提取物进行了系统的植物化学分析。正交分离系统在第一维CCC中使用了双相溶剂体系（n-己烷/乙酸乙酯/甲醇/0.1%甲酸水溶液，比例9:11:10:10，v/v），随后通过UHPLC-MS/MS进行分析和表征。该配置实现了80.47%的空间覆盖率。通过全面的离线2D CCC × UHPLC-MS/MS分离，共获得了约1328个峰。数据依赖采集模式（DDA）生成了高保真的MS²光谱，通过结合内部数据库、在线数据库和FBMN分析的集成工作流程，实现了全面的构型注释。该方法通过目标数据库匹配识别出263种化合物，FBMN分析还发现了15种额外的化合物（10种可能是新的天然产物，5种之前未在B. striata中报道）。系统分类显示有142种菲类化合物、37种联苯类化合物、16种蒽醌类化合物和68种其他化合物。这为B. striata的纤维根提供了迄今为止最全面的化学清单（2D CCC × UHPLC-MS/MS共278种化合物，而1D UHPLC-MS仅80种）。先进的可视化工具，包括分子网络和2D等高线图，提供了对结构关系和色谱保留行为的更深入理解。这个CCC × UHPLC-MS/MS-FBMN平台为植物化学分析树立了一个新的范例，具有广泛的应用前景，适用于天然产物研究和质量控制。

引言

天然产物的化学多样性是药物发现的重要资源库[1]。然而，在复杂的基质中高效分离和精确鉴定化合物仍然面临重大技术挑战。目前，一维液相色谱（1D LC）是最广泛使用的分析方法，应用于各种领域，如生物活性成分的筛选[2]、[3]、异构体分离[4]、食品和药物检测[5]、[6]、污染物监测[7]以及农药残留检测[8]、[9]。然而，面对高度复杂的基质时，1D LC技术存在技术局限性，包括峰容量低、分辨率不足和化合物覆盖范围有限。这些缺点常常导致峰重叠、基线隆起以及无法实现完全的基线分离[10]、[11]。因此，多维分析系统的开发成为了一种有前景的解决方案，具有更高的分辨率、更大的峰容量和更广泛的覆盖范围。

目前，二维色谱涵盖了多种满足分析需求的配置。全面二维液相色谱（2D LC × LC）整合了正交分离模式，如反相色谱 × 亲水相互作用，用于分离复杂的混合物（如生物分子）[11]、[12]，并利用UV和MS等检测器。全面二维气相色谱（2D GC × GC）通过调制器实现了超高的峰容量，与TOF-MS结合使用时非常适合挥发性混合物。混合2DC系统（例如LC × GC、LC × CE、CCC × LC、CCC × GC）结合了不同的技术，克服了一维方法的局限性，能够全面分析包括非挥发性极性化合物、半挥发性和大分子在内的复杂基质[13]、[14]、[15]、[16]。其中，二维逆流色谱 × LC（2D CCC × LC）在分析方法和制备分离方面都有应用，其在正交性、峰容量、灵敏度和分辨率方面显示出显著优势[15]、[17]、[18]。由于CCC具有固有的高样品加载能力及其基于液-液分配的非固定相分离机制，在第一维CCC分离后，复杂样品中的微量化合物能够在特定组分中有效富集。通过将其与第二维LC（基于极性和分子相互作用的分离机制）结合，构建了一个二维正交分离系统，表现出高灵敏度、优异的分辨率和高的峰容量。尽管这种CCC × LC配置在分辨率和峰容量方面可能不如传统的LC × LC系统，但其独特的高样品加载能力和由此产生的显著灵敏度使其在微量化合物检测方面表现出色，从而优于传统的LC × LC方法。

LC与高分辨率质谱（HRMS）的结合提供了前体离子和碎片离子的高精度结构信息，能够对化合物进行定性分析，并作为识别化合物结构的强大工具。在质谱数据解析中，基于内部和在线数据库的传统识别方法只能识别已报道的化合物，在探索新化合物方面存在显著局限性。分子网络（MN）技术是一种改进的化合物表征和识别技术，为复杂代谢组分析提供了革命性的工具。它广泛用于天然产物的化合物表征和药物发现[19]、[20]、代谢研究和生物标志物发现[21]、[22]。该技术通过MS/MS光谱相似性构建分子家族网络，实现对复杂基质的可视化表征[23]。在此基础上，基于MS¹信息（同位素分布、保留时间、离子迁移率）和MS²数据的基于特征的分子网络（FBMN）被开发出来，显著提高了异构体分辨率并减少了数据冗余[24]。这种基于光谱相似性的可视化计算策略实现了代谢物之间结构关联的可视化，将结构相似的化合物分类到不同的簇中，提供了一种“利用已注释化合物指导未注释化合物分析”的新方法，为发现新化合物和构建全面的化学谱型提供了新方法[25]。

Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f. 是兰科植物中的珍贵药用植物。它传统上被用作中药中的止血药物，其干燥的块茎被收录在中国药典中，称为“白芨”。然而，传统的B. striata采集方法是收集块茎部分，在工业采集过程中大量纤维根组织作为副产品被丢弃。我们之前的研究发现，B. striata的纤维根具有与其块茎相似的代谢谱，并具有显著的酪氨酸酶抑制活性，具有很大的开发价值[2]。然而，对B. striata纤维根的化学谱型的系统分析研究较少，传统的分析方法无法全面表征其复杂的代谢组，这限制了B. striata纤维根的进一步开发和利用。

因此，本文首次提出了一种结合离线2D CCC × UHPLC-MS/MS和FBMN的增强化学谱型表征策略，以B. striata的纤维根为案例进行研究（图1）。首先通过CCC的第一维分离实现目标物质的富集，然后在第二维中使用UHPLC进行分离。之后，HRMS采用数据依赖采集模式（DDA）获得每种化合物的高质量MS²光谱。结合内部数据库、在线数据库和FBMN，我们实现了更全面的化学组成表征。

试剂和材料

B. striata的纤维根购自山西省安康市，并由浙江工业大学药学院的楚楚教授进行了鉴定。凭证标本存放在浙江工业大学的中草药标本馆。

分析级甲醇、n-己烷、乙酸乙酯和乙醇购自上海Titan Scientific有限公司（中国上海）。LC级甲醇和乙腈也由该公司提供

B. striata纤维根的全面2D CCC × UHPLC-MS/MS表征

在二维分析研究中，心切割2D LC和全面2D LC是目前最常用的两种系统。在心切割2D LC配置中，可以从1D LC中分离目标峰进行第二维分析，从而实现高分离能力和低溶剂消耗。然而，这一过程不可避免地会导致一些化学成分信息的丢失。在在线全面2D LC中，1D LC的所有组分都经过无偏分离

结论

本研究开发并应用了一种增强的分析策略，结合了离线2D CCC × UHPLC–MS/MS和FBMN，实现了B. striata纤维根中非极性分子成分的系统化学表征。结合CCC和UHPLC–MS/MS的互补分离机制，该策略实现了更高的化合物覆盖范围、更多的微量成分检测和更好的异构体分离，同时确保了MS/MS数据的高质量。FBMN的结合

CRediT作者贡献声明

陈培谦：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、正式分析、数据管理、概念构思。范一雷：软件、资源。马晓霞：正式分析。李家军：正式分析。童胜强：软件、资源、概念构思。楚楚：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源、调查、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了浙江省自然科学基金（编号LY24H280007）、国家自然科学基金（编号82374017）和浙江省重点研发计划（编号2023C03038）的支持。