利用无有机溶剂的脂质纳米颗粒在体内进行肝外基因编辑

《Small》：Extrahepatic Gene Editing In Vivo Using Organic Solvent-Free Lipid Nanoparticles

　　**摘要**

靶向治疗通过修改基因及其表达方式，在治疗多种疾病方面展现了巨大潜力，这些疾病包括癌症、先天性代谢错误以及急性和慢性炎症及感染性疾病。然而，这一技术领域也面临着诸多挑战，例如RNA递送、免疫反应、递送载体的副作用以及需要个体化配方的问题。为了克服这些限制，可能需要重新评估脂质的选择和配方工艺，重点在于去除某些关键成分，如聚乙二醇（PEG）和乙醇。因此，我们开发了一种完全基于水的脂质纳米粒子配方，该配方具有材料效率高、节省时间且可重复性强的特点。最初使用了含有聚(2-甲基-2-噁唑啉)（PMeOx）的隐蔽脂质，后来配方中还加入了其他已批准的脂质。这些纳米粒子不仅能够高效地转染人体初级免疫细胞，在CRISPR-Cas9应用中也能有效地传递多个核苷酸。此外，体内实验表明，这些纳米粒子在肝外组织中的转染效果更为显著，这使它们区别于传统的富含胆固醇的脂质纳米粒子——后者无论通过何种给药途径主要都作用于肝脏。

## 1 引言

自从mRNA脂质纳米粒子（LNP）疫苗取得突破以来，基因转移技术已成为全球医学研究的前沿，带来了巨大的希望。目前至少有30种基于LNP的疗法已经获得批准或已进入I期临床试验阶段[1]。随着这项技术的广泛应用，科学界开始意识到LNP的局限性，比如其在肝外的运输能力、稳定性以及引发的免疫反应[2, 3]。这些局限性也影响了其在应对现代文明面临的重大健康挑战（如糖尿病、癌症和自身免疫性疾病）方面的应用[4-6]。有效的药物配方对于这些应用至关重要，而LNP作为一种传递核酸的重要载体应运而生[7-9]。预计该技术的发展将在先天性代谢错误等疾病的治疗领域产生重大影响，因为即使效果较低，基因编辑也逐渐显示出广泛的治疗潜力[10, 11]。即使在感染性疾病，尤其是败血症的情况下，针对肝脏的靶向治疗以及调节免疫细胞的功能以重新平衡机体反应也展现了改变这些疾病理解和治疗方法的潜力[12-14]。mRNA疫苗的获批、正在进行的临床试验以及其他有前景的治疗性核酸或治疗靶点的认可，都证明了这类编辑方法的可行性[15, 16]。虽然基于脂质的mRNA、siRNA或反义寡核苷酸（ASO）已被欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）接受，但无载体的质粒DNA（pDNA）疗法目前仅在日本获得批准[17]。pDNA具有稳定性更高、半衰期更长和长期表达等优点[18]。世界上首个CRISPR-Cas9疗法CASGEVY作为镰状细胞病的细胞疗法的获批，为未来的治疗靶点开辟了道路，而LNP可以在这方面发挥重要作用[19]。2025年5月，首个针对特定患者的CRISPR-LNP疗法的出现标志着该领域发展的最新进展，为基于LNP的个性化医疗奠定了坚实的基础[20]。现有的LNP药物Patisiran（Onpattro）、BNT162b（Comirnaty）和mRNA-1273（Spikevax）含有四种不同的脂质[21]。大多数配方的主要成分是一种pH响应型可离子化脂质[22]。可离子化脂质的不同类型会影响到核酸的递送效果[23]。为了提高稳定性并改善药代动力学和药效学特性，通常会在配方中添加基于聚乙二醇（PEG）的隐蔽脂质[24]。然而，PEG脂质的使用正受到越来越多的关注。由于PEG在日常生活中的频繁使用（例如在化妆品中的应用），现代社会中普遍存在抗PEG抗体[25, 26]。接触含PEG的药品（如基于PEG的COVID-19疫苗）进一步加剧了这一问题[27, 28]。据报道，针对PEG的免疫反应会加速其清除，并可能引发过敏反应[29, 30]。鉴于此，探索替代的隐蔽脂质变得尤为重要。其他聚合物（如两性离子聚合物[31, 32]、聚寡糖[33, 34]和聚(2-噁唑啉)[35, 36]，特别是聚(2-甲基-2-噁唑啉)（PMeOx）[37, 38]）成为潜在的PEG替代品。使用新型聚合物的优势在于它们在日常消费品中不常见，从而降低了患者预先接触的风险，进而减少了预先存在的不良免疫反应。值得注意的是，抗PEG抗体与其它聚合物（如聚(2-噁唑啉）之间没有交叉反应[39]。不过，长期使用是否会导致抗体形成仍需通过专门的长期研究来验证。通常，隐蔽脂质具有不同类型的脂质锚定基团，如饱和或不饱和的烷基链[40, 41]。例如，Lipopolyoxazolines（如PMeOx脂质）在组织分布和血液循环时间方面与常见的PEG脂质相当[42]。此外，PMeOx由于具有更高的亲水性，其在肝脏中的积累较少[43]。除了可离子化和隐蔽脂质外，LNP还包含其他辅助脂质。磷脂（如DSPC）有助于提高封装效率和稳定性，而胆固醇则有助于膜融合并避免与血浆蛋白结合，从而延长血液循环时间[44-46]。然而，胆固醇也会影响LNP在肝脏中的积累并影响免疫效应[2, 3]。因此，减少或去除配方中的胆固醇有助于更容易地实现肝脏以外的治疗目标。不含胆固醇的配方还允许采用替代和创新的LNP生产方法，因为这种高度疏水的化合物使得生产LNP时必须使用有机溶剂[47-49]。LNP的常见生产技术基于微流控或喷射混合，但涡流混合等其他混合方法也同样适用[50]。在这些过程中，有机脂相和水相会迅速混合，随后去除溶剂，并将配方调整至生理条件[51, 52]。这种配方过程耗时较长，且仅适用于小批量生产的个性化医疗应用。从工业角度来看，使用有机溶剂会增加制造成本，并引发安全问题，尤其是乙醇在穆斯林社区中存在争议。此外，欧洲药典和美国药典均要求在药品注射前去除乙醇[52, 53]。无有机溶剂的制造方法是克服这些缺点的一种途径。在本研究中，我们开发了一种快速、可重复且稳定的基于水的LNP制备方法，即所谓的“蓝色”脂质纳米粒子（BLNP），有效克服了现有局限性。最初，通过使用一种替代的隐蔽聚合物来弥补纯胆固醇的缺失。PMeOx与胆固醇半琥珀酸酯（CHEMS）结合，作为含胆固醇的隐蔽脂质，同时保持了水溶性。这使得能够在不含胆固醇的LNP配方中实现所需的功能，其物理化学特性得到了详细研究。BLNP在HEK293T细胞和人体初级白细胞中显示出高效性和生物相容性，并能够传递mRNA和pDNA。最终通过单次治疗成功实现了Cas9 mRNA和sgRNA的共递送，在94%的目标细胞中实现了基因敲除。此外，我们还探索了不含胆固醇且基于水的“蓝色”配方（SM-102、DSPC、DMG-PEG），其在体外显示出相似的效率，并在体内实现成功的基因递送。因此，我们开发了一种创新的LNP（BLNP）类型，无需使用有机溶剂或胆固醇，特别适用于小批量、基于应用的个性化生产，如个体化的CRISPR-Cas9疗法。

## 2 结果与讨论

### 2.1 蓝色脂质纳米粒子配方（BLNP）

胆固醇是LNP的重要组成部分，由于其疏水性，生产LNP时需要使用有机溶剂，其亲水-疏水平衡（HLB）值为1.6。HLB值是一个数值范围（从0到20），表示分子对水（亲水性）或油（疏水性）的相对亲和力。较低的HLB值对应更疏水的化合物，而较高的HLB值则表示更高的亲水性。该参数在乳化和纳米粒子制备中至关重要，因为它影响基于脂质的系统的溶解性和稳定性[47, 54]。为了实现无有机溶剂的LNP生产，必须从配方中去除纯胆固醇。为了在保留胆固醇积极特性的同时克服这一难题，我们使用了一种替代脂质。因此，选用了具有高生物相容性和优异水溶性的胆固醇 linked poly(2-甲基-2-噁唑啉)（CHEMS-PMeOx52）作为隐蔽脂质[55]。添加到配方中的可离子化脂质和磷脂均借鉴了已批准的LNP设计，从而得到了三组分组成的BLNP-1（图1）。要在水环境中发挥作用，材料通常需要在疏水性和亲水性之间达到平衡。HLB值介于7到9之间的脂质被认为具有良好的水分散性和乳化能力[47]。磷脂DSPC的HLB值为7.2，符合这一要求。可离子化脂质SM-102在质子化状态下也满足这些条件，并已在酸性水缓冲液中分散。表S1总结了所有使用的脂质，以及与商业LNP配方（mRNA-1273）的对比及其相应的HLB值。

**图1** BLNP-1与LNP-1的对比。(A) BLNP-1和LNP配方中使用的脂质概览。蓝色边框表示BLNP-1，棕色边框表示LNP-1。(B) BLNP-1的标准化组成（50 mol SM-102）和摩尔脂质比例（mol%）。该图表明，尽管BLNP中各组分的摩尔分数有所增加，但在相同的N/P比率下，传递等量核酸所需的净摩尔量是相同的。(C) BLNP-1的示意图。(D) BLNP的标准化组成（50 mol SM-102）和摩尔百分比。(E) LNP mRNA-1273的示意图。为了研究不同脂质组分在水环境中的作用，测试了多种脂质配方（F1-F4，图2A）。首先单独添加可离子化脂质（F1），然后是DSPC（F2）或CHEMS-PMeOx52（F3），最后将两者一起添加（F4）。混合均匀后，通过涡流混合加入pDNA（GFP）以实现核酸结合。之前也为经典LNP建立了类似的简单混合方法[56]。

**图2** 单一脂质在水基配方中的影响。(A) 不同配方（F1-F4）的组成。(B) F1-F4包封pDNA（GFP）的DLS测量结果（Z-Average）。每种配方从左到右分别对应N/P 3、6、9（氮磷比）。虚线表示最大可接受范围。(C) F1-F4的DLS测量结果（PDI）。虚线表示PDI 0.3，表示最大可接受范围。(D) 在HEK293T细胞中用3.0 μg/mL pDNA转染24小时后，通过流式细胞术检测到的GFP阳性细胞。(E) 在相同条件下，通过流式细胞术测定的F1-F4的存活细胞数量。数据以平均值±标准差表示。(B,C) 每组重复3次。(D,E) 每组3个生物重复，显示单个数据点。*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001，来自双因素方差分析（ANOVA）。脂质与pDNA（GFP）以不同的氮（SM-102）与磷酸盐（遗传物质）比例混合。DLS分析显示，将CHEMS-PMeOx52加入配方显著降低了颗粒大小（Z-Average）和多分散性指数（PDI）（图2B,C和图S1）。在N/P 3时，单独使用可离子化脂质无法形成纳米粒子（F1，Z-Average > 1000 nm），而加入CHEMS-PMeOx52（F3）即使在N/P 3时也能形成纳米粒子（Z-Average 290 nm）。这种尺寸缩小是隐蔽脂质的一个共同特征，证明了CHEMS-PMeOx52对潜在LNP配方的影响[15]。我们的同事进一步证明了CHEMS-PMeOx52的隐蔽特性，他们用这种聚合物对细胞外囊泡进行了改性，结果显示其在血液中的循环时间延长[57]。此外，随着N/P比值的增加，粒子大小的变化主要是由于在高N/P比值下质子化胺的静电排斥作用增强所致。这种效应在F1中最为明显，而N/P比为3时则不那么显著。在N/P为9时，即使不添加其他脂质，也能形成纳米颗粒（直径240纳米）。此外，还通过流式细胞术研究了HEK293T细胞中的转染效率（GFP阳性细胞的数量）和细胞存活率（图2D,E）。添加DSPC和CHEMS-PMeOx52后，转染效率得到了提高（在N/P为6时，F1提高了3%，F2提高了13%，F3提高了22%）。值得注意的是，所有配制的组合物都表现出良好的生物相容性，没有明显的毒性迹象（图2E）。结果显示，F4（SM-102/DSPC/CHEMS-PMeOx52/81.3/16.3/2.4）在N/P为6时是最佳配方（GFP阳性细胞比例为41%）。选择N/P为6也是因为其在效率和材料需求之间的平衡最为理想；这一比率也用于已批准的mRNA疫苗[58]。值得注意的是，这些配方中各脂质的相对摩尔分数比传统LNP配方中的要高，尤其是可电离脂质的摩尔分数（在标准LNP中约为50%，而在BLNP中约为80%）。重要的是，每种配方材料每输送单位核酸的有效质量或绝对数量保持不变（图1B,D），因为所有最终配方都是使用相同的N/P比6制备的。因此，摩尔分数的增加是由于有意省略了胆固醇，胆固醇通常是传统LNP配方的主要成分。通常情况下，较低的N/P比较理想，因为较高的脂质含量可能会增加材料潜在副作用的风险，如细胞毒性。在确定最佳摩尔配比后，进一步使用冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）研究了该配方，还观察到了纳米颗粒溶液中片层的形成（图S2）。因此，优化了配方过程，以获得小而单分散的BLNP并提高转染效率。在核酸包裹之前，通过超声处理而不是简单的涡旋混合来改善水性脂质悬浮液的均匀性。超声处理是一种常用的能量混合技术，以确保脂质混合物的均匀性[59]。通过这种过程，脂质在核酸不存在的情况下重新排列并形成预先形成的纳米结构（PFN）。这些纳米颗粒的形态通过cryo-TEM进行研究（图S3），发现主要是球形颗粒和囊泡结构。由于不含胆固醇，BLNP中仅有少数双相纳米颗粒，这可以通过纳米颗粒内部的电子对比度差异来识别[60]。随后，将这些PFN与核酸（GFP）在pH值5.5的条件下混合。由于环境保持酸性，带负电的核酸附着在带正电的PFN表面。混合过程导致PFN融合和脂质重新排列，从而实现核酸的包裹。包裹后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）中和纳米颗粒悬浮液的pH值以稳定颗粒，最终得到BLNP。BLNP形成的机制如图3A所示。形成了直径小于200纳米的纳米颗粒（Z-Average）（图3B）。Kulkarni等人也描述了在预形成的LNPs中包裹核酸的过程，证明在没有乙醇的情况下，siRNA的包裹效率很高[61]。最近，Tanaka等人报道了一种类似的mRNA LNP方法，他们强调了在预形成的囊泡中包裹mRNA时pH值的重要性[62]。使用超声法制备的BLNP-1的粒径比用涡旋混合法制备的颗粒小，介于170至190纳米之间（图2B，F4为250纳米）。为了研究核酸加入PFN以及pH值变化对颗粒完整性和大小的影响，进一步进行了动态光散射（DLS）和cryo-TEM测量，分别在pH值5.5和7.4条件下测量了PFN和颗粒（图S4和S5）。结果表明，核酸的加入不会影响颗粒大小，而pH值的变化会导致Z-Average值增加（130–180纳米）。这种由于pH值变化而导致的尺寸增加在标准LNPs中也很常见[61]。这些尺寸与作为参考颗粒的富含胆固醇的LNPs相当（图S6）。如cryo-TEM观察所示，BLNP的异质性与LNPs相当。与PFN类似，典型的囊泡结构比例也减少了[63, 64]。此外，使用pDNA（GFP）的转染效率从40.9%（涡旋混合，F4）提高到90.3%（BLNP-1，图3D），与LNP参考值相当（图S7）。

针对改进的BLNP-1配方的研究。(A) 以mRNA为例，提出了BLNP形成的机制。超声处理在水性缓冲液（20 mM醋酸钠，pH 5.5）中重新排列脂质，形成未装载核酸的预先形成的纳米结构（PFN）。将PFN与pH值为5.5的mRNA溶液混合后，核酸结合并融合，最终实现核酸的包裹。纳米颗粒悬浮液的pH值用PBS中和。中间和最终的纳米结构通过cryo-TEM观察得出。刻度尺为50纳米。更多图像见图S5。(B,C) 对装载mRNA (GFP) 或 pDNA (GFP) 的BLNP-1进行DLS测量（Z-Average, PDI）。(D,E) 在HEK293T细胞中研究BLNP-1装载mRNA (GFP) 或 pDNA (GFP) 的转染效率（GFP阳性细胞，rMFI）。数据以平均值±标准差显示。(B,C) n = 3次重复实验；(D,E) 3次生物学重复实验，每个数据点均独立计算。*p ≤ 0.05，***p ≤ 0.001，基于双因素方差分析（ANOVA）得出。为了扩展潜在应用的范围，随后研究了mRNA (GFP) 的输送效果。发现装载mRNA或pDNA的BLNP在大小和大小分布方面没有显著差异（图3B,C）。两种核酸之间的封装效率存在细微差异（图S8和S9及表S2；pDNA：80.3%，mRNA：74.8%）。定量分析显示，BLNP-1的mRNA结合效率低于LNP对照（89.7%）（图S9）。这可能是由于缺乏纯胆固醇，因为纯胆固醇被认为可以通过增加膜刚性来增强核酸的封装效果[45]。在传统LNPs中，胆固醇通常占比很大，往往超过30摩尔%[58]。值得注意的是，尽管对对照LNPs进行了多次洗涤步骤以去除有机溶剂和游离的mRNA，但仍检测到残留的游离mRNA。初步使用人字形芯片微流控混合器代替涡旋混合器并未提高mRNA的封装效率（图S10）。然而，实验表明微流控技术与BLNP技术的兼容性良好，这对扩大生产和未来的优化可能至关重要。pDNA和mRNA配方在生物性能上存在差异。使用mRNA时，表达GFP的细胞数量略有增加，从90%上升至98%（图3D）。然而，mRNA的GFP相对平均荧光强度（rMFI）值显著低于pDNA（图3E）。使用pDNA进行基因传递具有很大的前景，主要是因为它能实现目标基因的稳定和持久表达[65]。这两种核酸都适用于多种基因传递场景，体现了BLNP平台的灵活性和可靠性。表1提供了所有BLNP配方和所用核酸的概述。

BLNP-1配方方法：
SM-102摩尔%
DSPC摩尔%
隐形脂质摩尔%
核酸
缩写

BLNP-1
超声处理
81.3
16.3
2.4 (CHEMS-PMeOx52)
pDNA (GFP)
BLNP-1
mRNA (GFP)
mRNA (Cas9), sgRNA (Anti-GFP)
BLNP-1Cas9
mRNA (tdTomato)
BLNP-1tdT
mRNA (Cy5-GFP)
BLNP-1Cy5
mRNA (CRE)
BLNP-1CRE
BLNP-2
超声处理
81.3
16.3
2.4 (DMG-PEG)
pDNA (GFP)
BLNP-2
mRNA (GFP)
mRNA (CRE)
BLNP-2CRE

2.2 CRISPR-Cas9框架——mRNA和pDNA转染的评估
为了解决现代社会中普遍存在的疾病，基因治疗，特别是CRISPR-Cas9受到了广泛关注。有报道称，可以通过质粒、mRNA或结合特定sgRNA的核糖核蛋白来实现基因编辑[66, 67]。鉴于BLNP-1的基因传递潜力，进一步详细研究了mRNA和pDNA的传递，以确定哪种核酸更适用于成功的CRISPR-Cas9策略。具体来说，通过流式细胞术在HEK293T细胞中研究了0.10–3.00 μg/mL核酸范围内的剂量-反应GFP表达（图4）。结果表明，mRNA的转染效率明显优于pDNA。使用mRNA时，在0.28 μg/mL的浓度下，90%的细胞被转染，表明mRNA的效率是pDNA (GFP)的十倍（图4A，TC90 = 2.67 μg/mL）。然而，pDNA在0.75 μg/mL的起始浓度下表现出更高的蛋白质产量（图4B，rMFI）。这可以通过pDNA的转录在细胞水平上产生更多的mRNA分子来解释。商业脂质体（lipofectamine）也表现出类似的行为，显示出使用pDNA时蛋白质表达增加[69]。

图4：pDNA和mRNA的浓度依赖性基因表达。HEK293T细胞用含有pDNA (GFP) 或 mRNA (GFP) 的BLNP-1转染，并在24小时后通过流式细胞术测量。通过稀释配方后再加入细胞来施加不同浓度的pDNA和mRNA。虚线和阴影标记分别表示90%细胞呈GFP阳性的核酸浓度（TC90）和TC90时的rMFI值。数据以平均值±标准差显示（n = 3次生物学重复实验）。连接线通过GraphPad Prism进行非线性回归得出。mRNA的另一个优点是其在细胞内快速积累表达的蛋白质。初步实验表明，使用mRNA可以在2.9小时内转染90%的细胞，这与传统LNP标准（2.3小时）相当[39]。相比之下，pDNA则需要18.1小时才能达到类似的转染水平。此外，还观察到转染均匀性的差异，这反映在荧光强度直方图中。较窄的分布表明细胞群体中的转染更为均匀。尽管pDNA的整体表达水平略高，但信号在细胞中的分布更为分散（图S12）。这一发现与Kataoka研究小组的报告一致[70]。基于动力学研究，我们认为mRNA是CRISPR-Cas9策略中的更优选择。较低量的核酸就足以转染大多数细胞，这一点很有优势[71]。此外，在同时传递两种核酸（Cas9和相应的sgRNA）时，时间依赖性可能是关键因素。pDNA导致的Cas9表达延迟可能会妨碍功能性Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物（RNP）的及时形成。使用mRNA还因其获得批准的状态、降解潜力以及通过核苷酸修饰降低的免疫原性而受到青睐[72]。

2.3 使用BLNP的CRISPR-Cas9应用
由于sgRNA和Cas9蛋白必须在同一细胞中存在，因此考虑了它们的共同传递，特别是在潜在的体内应用中[73]。因此，共同配制了Cas9 mRNA和与目标基因（GFP）匹配的sgRNA。用含有Cas9 mRNA和sgRNA（BLNP-1Cas9）的BLNP-1处理稳定的GFP表达HEK293T细胞（HEK293T-GFP），并通过流式细胞术进行分析。观察了长达14天的不同时间点（图5B）。使用Lipofectamine messenger max作为阳性对照（LPFCas9）。BLNP-1Cas9处理后的细胞荧光强度随时间减少（图5A）。14天后，细胞的荧光强度与标准HEK293T细胞相当（虚线）。BLNP-1Cas9处理导致所有单个细胞中有94%发生敲除，总rMFI减少了95%，显著高于LPFCas9处理的结果（42%敲除）（图5C,D）。这种高敲除效率与其他研究体外敲除效应的LNP研究相当或更高[74]。图5：在图表查看器或PowerPoint中打开。

利用BLNP进行CRISPR-Cas9敲除GFP。(A) 在1-14天孵育后，通过流式细胞术分析的存活单个细胞的直方图。直方图被标准化为10,000个事件。计数表示三个生物学重复实验的平均值。(B) CRISPR-Cas9实验方案：HEK293T-GFP细胞被加载有Cas9 mRNA和anti-GFP sgRNA的BLNP-1处理，孵育14天后进行测量。(C) 孵育14后的敲除效率。(D) 随时间变化的rMFI降低。rMFI/%值是相对于对照组（黑色）进行标准化的。(E,F) 用tdTomato mRNA转染HEK293T细胞。24小时后的tdTomato阳性细胞（E）以及tdTomato MFI随时间的衰减（F）。NC代表使用不含纳米颗粒的自由核酸的阴性对照。Lipofectamine（LPF）用作阳性对照。数据以平均值（A, D, F）和平均值±标准差（C, E）显示（n = 3个生物学重复实验，应用了单个数据点）。***p ≤ 0.001，来自双向方差分析（ANOVA）。为了进一步区分表达蛋白的影响（MFI, rMFI），在实验设置中增加了额外的转染评估。因此，标准的HEK293T和HEK293T-GFP被平行培养，并将报告基因改为tdTomato（tdT）。由于LPF通常会导致较高的MFI值，因此用它作为对照[18]。LPFtdT的MFI比BLNP-1tdT增加了10倍（图5F）。考虑到LPFtdT转染的细胞较少（图5E，72%对比93%），可以假设对于某些治疗应用（如CRISPR-Cas9基因编辑），转染效率比蛋白质数量更为重要。这强调了需要根据特定应用调整蛋白质表达的合理性，因为高表达水平并非总是必要的。高表现载体的另一个缺点是，在潜在治疗后，蛋白质水平恢复到基础水平的速度变慢，这一点通过图5F得到证实。突变在不同患者之间可能有所不同，这使得用传统的大规模批量药物瞄准这些突变变得不那么吸引人，因此个性化医学成为克服这一障碍的强大工具[20, 75-78]。研究表明，BLNP可以在小规模上可重复地产生高CRISPR-Cas9敲除效率（三个独立生物学重复实验的相对标准差< 2%）。这一要求对于个性化医学可能至关重要，特别是因为它可以在本地医疗中心实施，而不是在大型工业设施中，因为一刀切的疗法在那里无效[77, 79]。

2.4 初级人类单核细胞的转染

免疫系统的初级细胞在各种疾病中起着关键作用[80]，尤其是在以宿主反应（包括免疫反应）失调为特征的危及生命的感染和败血症中[14]。这是一组具有特定宿主起源的多样化疾病。除了T细胞外，作为巨噬细胞的直接前体，单核细胞是免疫治疗的研究焦点[81]。为了评估BLNP-1对这些目标的潜力，研究了其对初级人类细胞的基因传递能力。从健康志愿者中分离出外周血单核细胞（PBMC）和多形核白细胞（PMNL）（图6A），并用封装了GFP mRNA的BLNP-1进行体外处理。通过使用针对表面标记物（分化簇CD）的不同的细胞特异性抗体（CD45、CD15和CD14）通过流式细胞术分离后（图6B），仅在CD14+单核细胞中观察到显著mRNA表达（图6E）。进一步使用Cy5标记的mRNA（BLNP-1Cy5）进行的摄取研究表明，CD14+单核细胞是BLNP-1的主要靶标（图6C，95%的Cy5阳性细胞）。淋巴细胞（30% Cy5阳性细胞）和中性粒细胞（CD15+）（20% Cy5阳性细胞）显示出较低的Cy5信号。值得注意的是，单核细胞仅占总白细胞计数的8%，而中性粒细胞占50%，并且具有显著的吞噬活性[82]。中性粒细胞更明显的吞噬行为也可能解释了这些细胞中几乎不存在mRNA翻译的现象，因为吞噬通常与快速的细胞内降解相关。相比之下，单核细胞具有内吞能力，这可能有利于与mRNA翻译兼容的细胞内处理途径[83]。文献描述了多种针对单核细胞的策略，包括基于颗粒大小或表面电荷的被动方法，以及通过特定受体（如叶酸或清道夫受体）的主动靶向[83, 84]。然而，在本研究中，实验环境中存在血清，这可能促进了颗粒表面的蛋白质冠层形成。这可能通过细胞表达的Fc受体促进了识别和摄取[85]。BLNP-1与血清蛋白的相互作用还通过溶血试验得到了进一步支持，在这些试验中，红细胞（RBC）暴露于高浓度的PFN中。在没有血清的情况下观察到了溶血效应，而在10%胎牛血清（FCS）或全血测量中则没有发生溶血（图S13）。值得注意的是，自由mRNA（NC）也被CD14+单核细胞摄取；然而，检查荧光强度时，BLNP-1显示出优势（图6D）。成功地将基因转移到初级人类单核细胞中表明，CRISPR-Cas9的潜在应用也是可能的。这为基因编辑的临床转化开辟了广泛的应用前景，因为基因编辑最近受到了关注[16, 19]。

图6：在图表查看器或PowerPoint中打开。

BLNP-1在人类初级白细胞中的转染和摄取。(A) 用BLNP-1（GFP mRNA）转染人类白细胞的工作流程。(B) 通过染色CD15和CD14分离出所有CD45阳性细胞，并分别进行分析。C) 通过流式细胞术分析，在4小时后使用Cy5标记的mRNA测量摄取情况。使用未经处理的缓冲液细胞（NTC）和自由mRNA处理的细胞（NC）作为阴性对照。数据以平均值±标准差显示（n = 3个生物学重复实验；应用了单个数据点）。(D) CD14+细胞的荧光强度分布（Cy5）。直方图表示n = 3个生物学重复实验的平均值。数据显示，与自由mRNA（NC）相比，封装在BLNP-1Cy5中的mRNA摄取量增加。(E) 通过流式细胞术分析的GFP阳性细胞。数据以平均值±标准差显示（n = 3个生物学重复实验；应用了单个数据点）。***p ≤ 0.001，来自双向方差分析（ANOVA）。体外处理也是一种可行的方法，如使用LNPs进行T细胞工程的研究所示。在这个过程中，T细胞在体外进行基因修饰，以增强它们的治疗特性，例如通过引入改善癌细胞识别和消除的受体[86]。基于LNPs的免疫疗法也提供了广泛的应用。例如，处理的巨噬细胞可以用于肿瘤治疗[87]。为了进一步评估细胞毒性，使用之前描述的PBMCs和PMNLs进行了LDH测定。结果显示，无论是BLNPs还是传统LNPs，都没有显著的LDH释放。同样，细胞因子分析也没有发现显著的异常。仅有两个供体的LNPs检测到适度的IL-1β释放，而TNFα和IL-6水平始终为阴性，支持了它们的低免疫原性（图S14）。Simon等人提供了支持CHEMS-PMeOx52生物相容性的额外证据，他们报告称静脉注射POxylated囊泡后没有肝功能受损[57]。

2.5 用于已批准脂质的蓝色配方——体外和体内研究

之前描述的隐形脂质（CHEMS-PMeOx52）是水基配方的初始基础。我们将这种材料与商业上获得FDA批准的隐形脂质DMG-PEG 2000（DMG-PEG）进行了比较。DMG-PEG也被证明适合用于BLNP配方（BLNP-2）。BLNP-2（SM-102、DSPC和DMG-PEG）显示出较小的直径（Z-Average 130 nm，PDI 0.1），与BLNP-1相当，并且其尺寸范围在传统对照LNP的范围内，无论使用何种核酸（图S15A,B,S16）。对HEK293T细胞的转染研究表明，使用GFP mRNA时超过95%的细胞呈阳性（图S15C,D）。值得注意的是，BLNP-1和BLNP-2在体外都没有显示出不良效应（图S17）。使用PrestoBlue测定在L929细胞上评估了细胞毒性，没有检测到它们的相对代谢活性降低。两种颗粒的zeta电位值均低于±2 mV（图S18），这在PBS中测量的屏蔽LNP的预期范围内[88]。这种几乎中性的zeta电位有利于延长循环时间，并减少与细胞膜的非特异性相互作用，否则可能会增加细胞毒性，这是传统PEG化LNPs的特点[89]。总体而言，含有mRNA或pDNA的BLNP配方在4°C储存至少12周期间在颗粒大小和PDI方面保持物理稳定（图S19–S21），并且在这些条件下的稳定性优于在-80°C储存的情况。特别是，冷冻会导致mRNA负载颗粒的聚集，如Z-Average大约增加了三倍，PDI > 0.5（图S19A–D）。这一观察结果与之前的报告一致，即在水悬液中LNPs在冷藏下的稳定性通常高于冷冻，这可能是由于冻融循环引起的结构应力[90]。尽管有这种明显的物理稳定性，但在4°C储存时，BLNP系统的功能活性逐渐丧失，这反映在体外转染效率的时间依赖性下降上（图S22）。综上所述，这些发现表明，无论是冷藏还是冷冻，水基储存都不是保持BLNP配方长期功能性能的最佳选择。克服这一限制的策略包括在冷冻前添加冷冻保护剂（如蔗糖），以及冷冻干燥纳米颗粒[51, 91]。因此，我们探索了BLNPs的冻干，这是一种用于稳定运输和储存敏感生物材料的成熟方法，最近在LNPs配方中获得了越来越多的关注[92, 93]。由于冷冻保护剂对此过程至关重要，我们研究了8.7%蔗糖的使用，先前的研究已经证明其对LNPs有效[94]。结果清楚地表明，特别是BLNP-2，在尺寸和分散性方面保持稳定（图S23A–C）。当添加蔗糖时，BLNP-1的Z-Average略有增加（从170 nm增加到200 nm），在PBS中储存和复溶后进一步增加到220 nm。BLNP-2的这种效应不那么明显。值得注意的是，未经蔗糖冷冻干燥的样本显示PDI增加，如DLS强度曲线所示（图S23A）。这些发现与观察到的生物性能一致。不含冷冻保护剂的样本几乎完全失去了转染效率，而含有蔗糖的样本保持了生物活性（图S23D,E）。然而，仍然观察到转染效率略有下降，特别是对于mRNA负载的颗粒（图S23E）。未来的研究应该基于这些储存发现，旨在在实际和简化的储存条件下保持生物功能。目前，似乎在冷冻保护剂存在下进行冻干是对BLNP配方最有前景的策略，尽管随后在冷冻条件下储存仍然是可取的。这些体外结果表明，胆固醇对于有效的mRNA传递并不是必需的。为了进一步研究胆固醇对体内表达和生物分布的影响，我们进行了动物研究，将BLNP-2与传统的LNP配方进行了比较。LNP脂质的摩尔组成与mRNA-1273相似，制备方法改编自之前的协议[39]。使用了loxP侧翼的tdTomato报告基因小鼠Gt(ROSA)26Sor9(CAG-tdTomato)Hze/J（Ai9），并且含有合成噬菌体P1循环重组（Cre）mRNA的纳米颗粒通过单侧肌肉注射（IM）和静脉注射（IV）施用于小鼠。动物在临床前评分中未显示出任何异常迹象，包括一般状况、自发反应和疼痛。实验过程中未观察到体重显著差异（图S24）。48小时后，收集了后肢肌肉、肺、肝、脾和血液。从每种组织中制备单细胞悬浮液，并使用流式细胞术分析其tdTomato表达，以比较IM和IV给药之间的细胞Cre重组（图7A）。

图7：在图表查看器或PowerPoint中打开。
对Ai9/Cre小鼠模型的不同组织进行流式细胞术分析。(A) Ai9小鼠分别通过肌肉注射（IM）或静脉注射（IV）接受了5 μg的CRE mRNA处理。在48小时后，从不同组织中收集了细胞，包括注射的肌肉（LM）、未注射的肌肉（RM）、肝脏（肝细胞（Hep）、肝脏非实质细胞（Hep-NPC）（包括肝脏免疫细胞、内皮细胞、星形细胞和胆管细胞）、脾脏（Spl）、肾脏（Kid）、血液（Blo）和肺部，并通过流式细胞术进行了分析。使用富含胆固醇的LNP和未处理的动物作为对照组。（B）每种纳米颗粒和注射方法的相对组织分布。分布是使用单细胞的相对平均荧光强度计算的。（C）未处理小鼠（NC，n = 6）、BLNP-2CRE IM（n = 4）、BLNP-2CRE IV（n = 3）、LNPCRE IM（n = 4）和LNPCRE IV（n = 4）的单细胞的平均荧光强度（tdTomato）。数据显示为均值±标准差（应用了单个数据点）。***p ≤ 0.001，来源于双向方差分析（ANOVA）。静脉给药后，BLNP-2CRE在脾细胞中检测到最强的信号（图7C）。在该组织中，大多数细胞（72%，图S25）是CD45+白细胞。因此，我们得出结论BLNP-2CRE主要转染这些细胞。相比之下，含胆固醇的标准LNP主要在肝脏（Hep, Hep-NPC）中检测到。尽管在脾脏中也观察到了转染，但超过80%的相对检测信号在肝脏组织中（图7B）。Kauffman等人[95]在类似的小鼠模型中也报告了这种主要的肝脏表达。值得注意的是，这在静脉和肌肉注射后都是如此。这与BLNP-2CRE显著不同，后者在肝脏中诱导的tdTomato表达明显较低。在静脉注射BLNP-2CRE后，只有0.2%的肝细胞显示tdTomato阳性，而LNPCRE为2.4%（图S26），相差10倍。这与胆固醇的分布模式有关。据报道，胆固醇通过ApoE结合促进LNPCRE的摄取，从而建立LDL受体亲和力，使其能够主动摄取[96, 97]。这可以解释传统含胆固醇LNP在肝脏中的高亲和力。Kawaguchi等人[98]还证明了减少胆固醇量后肝表达的降低。BLNP-2CRE不含胆固醇，这可能解释了其较低的肝脏趋向性。其他机制，如之前讨论的免疫细胞（包括单核细胞）通过蛋白质介导的摄取，可能更为显著，并可以解释观察到的脾脏表达[85]。未来需要专注于细胞特异性生物分布的研究，以更好地理解这些机制。另一个有趣的发现是肌肉注射后的信号分布。注射肌肉中的局部信号强度对于BLNP-2CRE和LNPCRE来说是相同的。在局部，LNPCRE在效果上没有优势。如前所述，肌肉注射后，LNPCRE的效果主要在肝脏中观察到。然而，对于疫苗的成功来说，肝细胞中的效果并不重要，因为抗原呈递细胞的转染对于这一目的是至关重要的[99]。

3 结论
mRNA脂质纳米颗粒（LNP）疫苗的广泛应用将基因转移带到了全球医学研究的前沿，并产生了相当的乐观情绪。然而，随着这项技术的进步，需要解决与肝外运输和免疫激活相关的挑战。这突显了蓝色配方方法的好处，它能够生产出强效的纳米颗粒，而不会显著积累胆固醇，从而避免了经常观察到的肝脏积累。BLNPs进一步代表了一种有前景的进展，实现了体内基因传递，并简化了生产过程。完全避免了通常需要额外纯化步骤的有机溶剂的使用。预形成的脂质组装体的生产也允许小规模和灵活的方法，这对于实验室筛选或炎症性疾病实体中的个性化医疗特别有利，在这些疾病中免疫细胞特别受关注。可以生产出大量的预组装BLNP，然后分别使用灵活的、经过修改的活性药物成分进行实验或针对患者。这一点通过使用类似的脂质混合物来包裹不同的核酸得到了证明。未来的研究应该扩展到体内调查，包括全面的药代动力学分析和体内毒性评估，最终实现临床准备就绪。此外，这些结果建议重新评估胆固醇在LNPs中的作用，表明纯胆固醇对于基因表达并不是必需的，特别是对于免疫细胞而言。这些发现有助于不断理解胆固醇在LNPs中的作用，促使人们重新考虑传统的LNP配方，以更好地理解其在各种环境下的功能。与胆固醇相关的副作用，如增强免疫反应和肝脏积累，在某些疾病中可能会非常不利，而这里描述的配方可以避免这些问题。

4 实验部分
详细的实验部分包含在支持信息中。

4.1 伦理
人类白细胞浓缩物由德国图林根州耶拿大学医院的输血医学部门提供。对人PBMCs和白细胞的研究中的转染已获得当地伦理委员会的批准（批准编号5050-01/17），并按照指南和法规进行。所有动物实验均按照德国图林根州行政办公室批准的协议（Reg. No. UKJ-20-013）进行。

4.2 通过超声法制备蓝色脂质纳米颗粒（BLNP）
为了制备BLNP储备溶液，使用可电离的脂质SM-102（H?lzel，目录编号DCC-DC52025-1 g）、磷脂DSPC（Avanti，目录编号850365P）以及stealth脂质CHEMS-PMeOx52 [55]或DMG-PEG 2000（Avanti，目录编号880151P），在pH值为5.5的20 mM醋酸钠缓冲液（NaOAc）中制备（Thermo-Fisher Scientific Inc.，目录编号AM9740）。用于缓冲液稀释的是UltraPure水（Invitrogen，目录编号12 060 346）。在配方之前，将储备溶液调整到室温并通过将其放置在室温下的超声浴中15分钟来均质化。然后将脂质在NaOAc中混合，以获得定义的脂质摩尔比，并用超声均质器（Hielscher Ultrasonics GmbH，目录编号UP200St）在冰上处理2次，每次20秒，以生成未装载的预成形纳米结构（PFN）。颗粒在室温下孵育10分钟。在NaOAc中准备了浓度为120 μg/mL的核酸混合物（MM）。通过将其与MM 1 + 1混合，然后孵育15分钟来装载BLNP。为了获得最终的BLNP，混合物补充了1 + 1 PBS（Capricorn，目录编号PBS-1A）。

4.3 用pDNA（GFP）和mRNA（GFP）转染HEK293T细胞
HEK293T细胞（DSMZ，目录编号ACC 635）在37°C、湿度为5%（v/v）的CO2环境中，在Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）低葡萄糖（1 g L?1）（Capricorn，目录编号DMEM-LPA）中培养。培养基中补充了10%（v/v）胎牛血清（FBS）（Capricorn，目录编号FBS-11A）、100 U/mL青霉素（Capricorn，目录编号PS-B）和100 μg/mL链霉素（Capricorn，目录编号PS-B）（培养基）。实验中，将0.2 × 10^6个细胞接种在含有10 mM HEPES（测试介质）的500 μL培养基中，在24孔板中培养24小时。处理前1小时，将培养基更换为450 μL测试介质。细胞用上述方法准备的纳米颗粒处理，含有pDNA（Addgene，目录编号54 767，使用EndoFree Plasmid Mega Kit（5）（Qiagen目录编号12 381）分离）或PureBoost Modified（m1Ψ）EGFP mRNA（Cellerna，目录编号2001M-1MG），以达到最终核酸浓度为3.0 μg/mL。为了达到低于3.0 μg/mL的浓度，用PBS（Capricorn，目录编号PBS-1A）和20 mM NaOAc缓冲液（pH 5.5）的1 + 1混合物稀释BLNP。孵育24小时后，上清液转移到新的24孔板中。细胞立即用trypsin-EDTA分离，重新悬浮在相应的上清液中，并通过流式细胞术（CytoFLEX，Beckman Coulter，美国）进行分析。至少测量了10,000个事件，并通过前向和侧向散射（FSC/SSC）分析活的单个细胞。荧光在λEx = 488 nm下测量，使用525/40 nm带通滤光片（FITC通道）。通过仅用核酸处理的细胞进行门控来识别阳性细胞（MM）。详细的门控策略在支持信息中提供（图S27）。分析使用CytExpert V 2.5.0.77进行。

4.4 使用CRISPR-Cas9在HEK293-GFP稳定细胞中进行GFP敲除
为了评估CRISPR-Cas9的敲除效率，使用了HEK293-GFP稳定细胞（AMSBIO，目录编号SC001）。将0.2×10^6个细胞接种在24孔板的500 μL测试介质中，并培养24小时。处理前1小时，将培养基更换为450 μL新鲜测试介质。细胞用上述方法准备的含15 μg/mL mRNA（Cas9）（OZ Biosciences，目录编号MRNA25-100）和15 μg/mL sgRNA（Anti-GFP）（Synthego，目录编号GRWCY6G；G*G*U*CUACAAGACCCGCGCCG + modified Scaffold）的BLNP-1Cas9处理，以达到最终核酸浓度为3.0 μg/mL。sgRNA序列是使用CRSIPOR网站工具[100]确定的。更多细节在支持信息中提供（sgRNA信息）。参考细胞还用含30 μg/mL mRNA（tdTomato）（OZ Biosciences，目录编号MRNA2-100）的BLNP-1tdT处理，以观察转染情况。此外，细胞还用Lipofectamine MessengerMAX（Thermo Fisher Scientific Inc., 目录编号LMRNA001）作为阳性对照（LPF）处理，其中含有上述描述的相应核酸，并按照制造商的说明制造。孵育24小时后，去除上清液。细胞立即用trypsin-EDTA分离，并重新悬浮在1 mL培养基中。将每个孔的500 μL转移到新的24孔板中（1 + 1分配）并继续培养。剩余的细胞通过流式细胞术（1天）进行分析。至少测量了10,000个事件，并通过前向和侧向散射（FSC/SSC）分析活的单个细胞。荧光在λEx = 488 nm下测量，使用525/40 nm带通滤光片（FITC通道）（GFP）和λEx = 561 nm下使用585/42 nm带通滤光片（Y585-PE通道）（tdTomato）测量。细胞进一步培养14天，并在3天、5天、7天和14天后再次进行上述测量。在最初的7天内，细胞持续以1:1的比例分裂。从第7天开始，调整分裂比例以防止细胞密度超过90%，直到第14天。详细的门控策略在图S28中提供。

4.5 用BLNP-1转染人类原始PBMC和PMNL
如支持方法（人类原始PBMC和PMNL的分离和培养）中所述，用BLNP-1处理PBMC和PMNL，其中mRNA（GFP）的制备方式与HEK293T细胞的转染相同。孵育18小时后，细胞离心5分钟，400 rcf。随后，轻轻去除上清液，并加入0.2 M PBS-EDTA（VWR，目录编号A2937 0500）以分离粘附细胞。孵育3分钟后，将细胞转移到96孔板（V-bottom）中，并在4°C下离心5分钟，400 rcf。去除上清液，然后用BD Pharmingen Stain Buffer（FBS）（BD，目录编号554 656）（FACS-buffer）洗涤细胞。在FACS-buffer中准备了包含PE-CD45（BioLegend，目录编号304 039）、PerCP-CD15（BioLegend，目录编号323 018）和APC-CD14（BioLegend，目录编号301 808）抗体的抗体混合物。在额外的洗涤步骤后，向每个孔中加入100 μL ABC，并在黑暗中于4°C下培养30分钟。孵育后，立即加入100 μL FACS-buffer，细胞重新悬浮并再次离心5分钟，400 rcf，然后用FACS-buffer洗涤，并通过流式细胞术进行分析。通过FSC/SSC识别活的单个细胞。使用510/20 nm带通滤光片（带有信号衰减）（B510-GFP-ND1通道）在λEx = 488 nm下测量荧光，并使用585/42 nm带通滤光片（B510-GFP-ND1通道）（GFP）和λEx = 561 nm下使用585/42 nm带通滤光片（Y585-PE通道）（tdTomato）测量荧光。细胞进一步培养14天，并在3天、5天、7天和14天后再次进行上述测量。在最初的7天内，细胞持续以1:1的比例分裂。此后，从第7天开始调整分裂比例，以防止细胞密度超过90%。详细的门控策略在图S28中提供。

4.5 用BLNP-1转染人类原始PBMC和PMNL
如支持方法（人类原始PBMC和PMNL的分离和培养）中所述，用BLNP-1处理PBMC和PMNL，其中mRNA（GFP）的制备方式与HEK293T细胞的转染相同。孵育18小时后，细胞离心5分钟，400 rcf。随后，轻轻去除上清液，并加入0.2 M PBS-EDTA（VWR，目录编号A2937 0500）以分离粘附细胞。孵育3分钟后，将细胞转移到96孔板（V-bottom）中，并在4°C下离心5分钟，400 rcf。去除上清液，然后用BD Pharmingen Stain Buffer（FBS）（BD，目录编号554 656）（FACS-buffer）洗涤细胞。在FACS-buffer中准备了抗体混合物（ABC），其中包含PE-CD45（BioLegend，目录编号304 039）、PerCP-CD15（BioLegend，目录编号323 018）和APC-CD14（BioLegend，目录编号301 808）。在额外的洗涤步骤后，向每个孔中加入100 μL ABC，并在黑暗中于4°C下培养30分钟。孵育后，立即加入100 μL FACS-buffer，细胞重新悬浮并再次离心5分钟，400 rcf，然后用FACS-buffer洗涤，并通过流式细胞术进行分析。通过FSC/SSC识别活的单个细胞。使用510/20 nm带通滤光片（带有信号衰减）（B510-GFP-ND1通道）在λEx = 488 nm下测量荧光，并使用585/42 nm带通滤光片（Y585-PE通道）（tdTomato）在λEx = 561 nm下测量荧光。细胞进一步培养14天，并在3天、5天、7天和14天后再次进行上述测量。在最初的7天内，细胞持续以1:1的比例分裂。随后，从第7天开始，调整分裂比例，以防止细胞密度超过90%，直到第14天。详细的门控策略在图S28中提供。分析使用Kaluza V 2.2.1进行。分析使用了Kaluza V 2.2.1软件进行。

4.6 使用BLNP-1进行的人类原代PBMC和PMNL的摄取研究

如上所述，接种的PBMC和PMNL用之前制备的BLNP-1处理，该BLNP-1负载有Cy5标记的mRNA（OZ Biosciences，定制）。4小时后的测量按照上述方法进行，将CD14抗体替换为BV510-CD14（BioLegend，目录号367 124），使用405纳米激光和525/40纳米带通滤光片进行检测。通过应用638纳米激光和660/10纳米带通滤光片测量活性单个细胞中的Cy5信号来检测摄取情况。详细的门控策略见图S30。分析使用了Kaluza V 2.2.1软件进行。

4.7 动物实验

B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor9(CAG-tdTomato)Hze/J (Ai9)小鼠（RRID: IMSR_JAX:007909）来自美国杰克逊实验室，并在德国耶拿大学医院的动物设施中纯合繁殖。该品系具有一个loxP侧翼的STOP盒，该STOP盒被 strategicly 安置以抑制由CAG启动子驱动的tdTomato转录，tdTomato是一种单体红色荧光蛋白的变体。当Bacteriophage P1 Cre重组酶在Ai9小鼠中表达时，表达Cre的细胞会发生显著变化：在Cre重组酶活跃的组织中，STOP盒被切除，导致这些特定区域出现强烈的tdTomato荧光[101]。小鼠处于12小时明暗循环的环境中，温度为22°C，湿度为40%-50%。它们被喂食标准啮齿动物饲料，并可以自由饮用酸化水。所有小鼠的基因型都得到了确认。因此，从耳部取样提取DNA，并使用KAPA小鼠基因分型试剂盒（Merck，编号KK7302）进行扩增。使用以下引物检测野生型等位基因（正向：5’- AAGGGAGCTGCAGTGGAG TA-3’，反向：5’- CCGAAAATCTGT GGGAAGTC-3’）和突变型等位基因（正向：5’- GGCATTAAAGCAGCGTATCC-3’，反向：5’- CTG TTCCTGTACGGCATGG-3’）进行PCR扩增：初始变性（94°C，5分钟），然后进行28个循环的扩增（94°C × 30秒 – 58°C × 30秒 – 72°C × 30秒），最后在72°C下扩展5分钟以确保任何剩余单链DNA的完全延伸，最后在Biometra TAdvanced热循环仪（Analytik Jena，德国耶拿）上以4°C无限期保持。扩增产物通过含有0.5 μg/mL溴化乙锭的2%常规琼脂糖凝胶（在Tris-Acetate-EDTA缓冲液（0.04 M Tris，0.02 M醋酸，1 mM EDTA，pH 8.3中）中进行琼脂糖凝胶电泳（所有材料均来自Carl Roth，德国），并在UV光下使用G:Box chemi XRQ（Syngene）仪器观察，以确认196 bp处的突变带。

4.8 Ai9小鼠的体内转染

实验使用了8-12周大的雄性和雌性Ai9小鼠。每组2只雄性和2只雌性小鼠通过肌肉注射或静脉注射5 μg的BLNP-2CRE或对照LNPCRE形式的mRNA，具体方法如实验部分所述。所使用的mRNA（OZ Biosciences，目录号MRNA26 1000）编码Bacteriophage P1 Cre重组酶。注射在异氟醚麻醉和美洛昔康镇痛下进行。小鼠被孵育48小时后，通过腹腔注射氯胺酮和唑拉西秦过量处理后进行组织收集和细胞分离。为了生成基线数据，每个实验都包括未处理的Ai9小鼠的细胞。死亡后立即通过心脏穿刺收集全血。从肺、肝、脾、肾以及左右后肢肌肉中制备单细胞悬浮液和快速冷冻样本，用于tdTomato蛋白及其mRNA的定量。

4.9 单细胞分离和流式细胞术

从血液中制备单细胞悬浮液，并收集所有固体组织。100 μL全血在室温下用1 mL 1X红细胞（RBC）裂解缓冲液（Biolegend，目录号420 302）处理5分钟，然后用9 mL 1X DPBS（Carl Roth GmbH，目录号9150.1）终止裂解。通过离心（500 rcf，5分钟，室温）收集白细胞。重复红细胞裂解以提高白细胞纯度。为了分离脾细胞，将三分之一的脾脏切成小块，用研磨器研磨，然后通过100 μm灭菌尼龙网过滤。脾细胞随后通过离心（500 rcf，5分钟，4°C）收集，再重新悬浮在1 mL RBC裂解缓冲液中，进行与血液相同的裂解处理，并用染色缓冲液（5% FBS，5 nM EDTA在DPBS中）洗涤一次。肝、肺、肾、左右肌肉切成小块，在37°C下用2 mL RPMI1640（PAN BIOTECH，目录号P04-16515）溶液和0.2 mg/mL胶原酶IV（Worthington，目录号44B24 298）消化45分钟，然后用相同体积的含有10% FBS的RPMI（Thermo Fisher Scientific，目录号10 270 106）洗涤。消化后的组织通过100 μm尼龙网过滤。肝细胞悬浮液首先在室温下以50 rcf离心5分钟进行沉淀。上清液转移到新管中，然后在500 rcf下离心5分钟以收集肝非实质细胞（NPCs），包括免疫细胞（例如Kupffer细胞、淋巴细胞、星形细胞）和内皮细胞。肝NPCs的裂解方法和全血相同，然后用染色缓冲液洗涤一次。来自肺、肾和肌肉的悬浮液以500 rcf离心5分钟，再进行相同的RBC裂解，并用染色缓冲液洗涤一次。通过流式细胞术分析分离出的细胞。使用585/42纳米带通滤光片（PE-Channel）和561纳米激光检测tdTomato信号（CytoFlex，Beckmann Coulter）。详细的门控策略见图S31。分析使用了Kaluza V 2.2.1软件（Beckmann Coulter）。为了进一步鉴定脾样本中的CD45+细胞数量，额外的细胞悬浮液在4°C下用50 μL Fc阻断缓冲液（Miltenyi，目录号130-092-575）孵育10分钟。然后将在黑暗中用PerCP-CD45（Biolegend，克隆：30-F11，目录号103 130） stained 30分钟。在500 rcf下用染色缓冲液洗涤一次后，重新悬浮在200 μL染色缓冲液中。使用488纳米激光和690/50纳米带通滤光片检测PerCP-CD45。详细的门控策略见图S32。分析使用了Kaluza V 2.2.1软件（Beckmann Coulter）。

4.10 统计分析

统计分析使用GraphPad Prism（版本10.3.1）进行。数据呈现（例如，平均值 ± 标准差或平均值 + 标准差）和统计分析方法在图例中描述。进行单因素或双因素方差分析（ANOVA）以比较多个组。统计显著性表示如下：ns p > 0.05，*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001。

作者贡献

M.S.参与了概念化、数据管理、正式分析、研究、方法论、可视化和撰写原始草稿。N.L.参与了撰写原始草稿、数据管理和研究。L.S.参与了撰写、审阅和编辑。F.A.参与了撰写、审阅、编辑、数据管理和研究。V.B.参与了撰写、审阅、编辑、数据管理和研究。L.G.参与了撰写、审阅、编辑、数据管理和研究。S.H.参与了撰写、审阅、编辑、数据管理和研究。S.S.参与了撰写、审阅、编辑和监督。O.W.参与了撰写、审阅、编辑和监督。V.L.参与了撰写、审阅、编辑和监督。M.M.参与了撰写、审阅、编辑和监督。M.B.参与了撰写、审阅、编辑和监督。A.T.P.参与了撰写原始草稿、方法论、监督和概念化。U.S.S.参与了撰写、审阅、编辑、监督和资金获取。

致谢

作者衷心感谢德国联邦教育和研究部（BMBF，项目编号13XP5034A PolyBioMik和03RU2U071H，ATHANA）、DFG项目PolyTarget（SFB 1278，项目B01、B08、C04、C06、D02、Z01，项目ID：316213987）以及法国国家研究局（ANR-20-CE09-0011-01）的支持。作者还感谢Joachim Herz基金会和Carl Zeiss基金会（P2024-02-016，Durchbrüche）的支持。A.T.还感谢DFG的资助（项目编号514006196）。作者还感谢“Thüringer Aufbaubank（TAB”（2021 FGI 0005，2023 FGR 0077）和“Europ?ischer Fond für regionale Entwicklung（EFRE）”（2018 FGI 0025）的支持。这项研究还得到了Hubert Curien Partnership（Campus France）和DAAD（德国学术交流服务，项目编号57604510）PROCOPE 2022计划的支持，该计划允许Laurianne Simon博士在JCSM工作。作者感谢Carolin Kellner和Sandra Henk在细胞培养方面的帮助，以及Elisabeth Moek在凝胶电泳和流式细胞仪研究中的协助。耶拿大学的Jessica Hoff博士负责监督动物实验。图表使用BioRender.com创建。

利益冲突

M.S.、A.T.和U.S.S.提交了与本研究结果相关的专利申请。作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可根据合理要求向相应作者索取。