《npj Biosensing》：Ultrasensitive non-enzymatic protein detection using proximity immunoassay with photonic resonator absorption microscopy
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为克服现有邻近分析技术因依赖酶促扩增、热循环及复杂昂贵设备而受限的难题，研究人员开发了名为PINATA（邻近引发核酸靶标放大）的分析方法。该方法在室温下通过简单的两步、90分钟流程，利用toehold介导的链置换反应实现无酶线性扩增，并结合光子谐振腔吸收显微镜（PRAM）进行数字检测，实现了对人白介素-6（IL-6）的低至37 fg/mL的检测限、6个数量级的动态范围及出色的选择性，在复杂样本基质中亦表现良好，为生命科学研究和诊断提供了强大的蛋白质定量工具。
在生命科学研究和临床诊断中，蛋白质作为关键的生物标志物，其精准定量对于理解疾病状态至关重要。然而，传统的蛋白质检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA），其灵敏度通常在皮克每毫升（pg/mL）级别，远低于核酸检测技术（如PCR）所能达到的阿托摩尔（attomolar）至飞摩尔（femtomolar）级别。这种“灵敏度鸿沟”限制了在极低丰度蛋白质检测、早期疾病筛查等场景中的应用。尽管通过将蛋白质信号转换为核酸进行扩增的邻近分析技术（如邻近连接分析PLA、邻近延伸分析PEA）显著提高了灵敏度，但它们普遍依赖酶促扩增（如PCR），需要复杂的温度控制、精密的仪器和严格的存储条件，且成本高昂，难以在即时检测（Point-of-Care）等场景中广泛推广。因此，开发一种无需酶促反应、操作简便、快速且能实现超高灵敏度的蛋白质检测平台，成为该领域亟待突破的瓶颈。
为了应对这一挑战，本研究提出并验证了一种名为“邻近引发核酸靶标放大”（Proximity Initiated Nucleic Acid Target Amplification, PINATA）的全新检测策略。该工作成功地将无酶的、基于熵驱动的核酸分子电路与高灵敏度的数字光学检测技术相结合，实现了在室温下快速、超灵敏的蛋白质检测。相关研究成果已发表在《npj Biosensing》期刊上。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：1. 抗体-寡核苷酸（AbO）偶联技术：将特异性抗体与设计的DNA探针序列共价连接，形成可识别目标蛋白并触发后续核酸反应的“智能探针”。2. Toehold介导的链置换反应（Toehold-Mediated Strand Displacement, TMSD）：作为无酶信号放大与转换的核心机制，利用DNA链的部分互补区域（toehold）引发精确、可编程的链置换级联反应。3. 光子谐振腔吸收显微镜（Photonic Resonator Absorption Microscopy, PRAM）：一种低成本、便携式的数字光学检测平台，通过计数结合在光子晶体（Photonic Crystal, PC）传感器表面的单个金纳米颗粒（AuNP）实现信号的数字化定量。4. 使用磁珠对关键核酸复合物（如桥-报告链双链体、AbO复合物）进行纯化，以降低背景信号。研究中用于验证的蛋白质靶标为人白介素-6（IL-6），并在缓冲液以及商品化的人血清和血浆基质中进行了性能测试。用于方法学比较的细胞样本来源于经肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激的HeLa细胞培养上清。
研究结果
PINATA的设计
PINATA方法的核心在于通过两个抗体-寡核苷酸（AbO）探针和双重toehold介导的链置换反应，将目标蛋白质转换为一段短的单链DNA报告序列。如图1所示，只有当两个AbO探针因结合同一蛋白质目标而被拉近时，才能协同作用，从预先杂交的“桥-报告链”双链体中置换出报告链。释放出的报告链随后激活一个靶标循环放大过程（Target Recycling Amplification Process, TRAP），通过多步链置换反应，使单个报告链能够将多个金纳米颗粒（AuNP）捕获到光子晶体（PC）表面。最后，使用PRAM对这些结合的AuNP进行逐个成像和计数，实现信号的数字化输出。
报告链toehold介导放大电路的测试与验证
研究设计了四种不同长度的报告链及其对应的放大体系（BR4, BR5, BR6, BR7）。通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）和PRAM检测验证了该放大电路的有效性。结果表明，所有体系均能成功放大报告信号，其中报告链5（R5）的体系在PRAM上能在30分钟内检测到低至1 aM的浓度，且动态范围宽。
PINATA assay的设计与优化
初期使用链霉亲和素-生物素模型系统对探针体系进行优化。通过调整桥-报告链双链体中部“调谐区域”的长度，可以热力学调控报告链释放的速率。结果表明，BR5和BR6体系在背景信号控制和阳性信号响应之间取得了最佳平衡，而BR4背景高，BR7阳性信号弱。纯化后的BR5双链体与生物素化探针结合PRAM系统，可检测低至10 fg/mL的链霉亲和素。
使用抗体-寡核苷酸偶联物通过Native PAGE检测人IL-6的PINATA assay
将AbO探针应用于人IL-6检测。通过Native PAGE比较了单克隆和多克隆抗体偶联物的性能。结果显示，经磁珠纯化后的单克隆AbO探针体系（BR5）具有更高的信噪比和阳性信号，被选用于后续数字化检测。
使用光子谐振腔吸收显微镜（PRAM）数字化检测IL-6的PINATA assay
将优化后的PINATA assay（使用BR5和单克隆AbO）用于PRAM数字化检测人IL-6。采用两步法：首先将目标IL-6、AbO探针和BR5双链体孵育1小时以触发报告链释放；然后将混合物与放大组件（LP双链体和AuNP-探针）加至捕获链功能化的PC表面，反应30分钟后成像。标准曲线显示，该方法对IL-6的检测范围跨越1 fg/mL至100 ng/mL共6个数量级，计算得出的检测限（LOD）为37 fg/mL。该方法对非靶标细胞因子（IL-2, IL-10）和人血清白蛋白（HSA）表现出高选择性。在加标到商品化人血清和血浆的复杂基质中检测IL-6时，未观察到显著的信号效率损失。此外，使用PINATA assay检测经TNF-α刺激的HeLa细胞培养上清中的IL-6，其结果与商品化ELISA的检测结果具有良好的一致性，验证了该方法在实际生物样本中定量分析的准确性。
研究结论与讨论
本研究成功开发并验证了PINATA这一创新的蛋白质超灵敏检测平台。其重要意义在于首次将无酶的、基于toehold介导链置换的邻近检测原理与线性信号放大及PRAM数字检测技术独特地结合起来。PINATA assay实现了多项关键优势的整合：无需酶促反应和热循环，全部过程在室温下完成；操作流程简单快捷，总时长约90分钟；灵敏度极高，对IL-6的检测限达37 fg/mL，动态范围宽达6个数量级；选择性好；抗基质干扰能力强；且使用的PRAM检测仪器成本较低，有望推向即时检测应用。
该研究不仅为蛋白质生物标志物的检测提供了一种强大的新工具，其设计理念也具有广泛的拓展性。PINATA中用于转换蛋白质信号的核酸电路，可以适配其他信号读出方式（如荧光、电化学）和其他扩增技术。所使用的亲和试剂也不限于抗体，可扩展至适配体（Aptamer）、纳米抗体（Nanobody）等，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用、转录后修饰乃至特定的核酸靶标（如mRNA剪接变体）。因此，PINATA assay代表了一种灵活、通用的超灵敏生物传感平台，有望在生命科学研究、临床诊断和基础生物学发现等多个领域发挥重要作用，推动精准医疗和即时诊断的发展。
