《Nature Communications》：Miniature and versatile genome regulation TnpB-ωRNA toolkits facilitate cancer immunotherapy
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本研究针对CRISPR-Cas系统尺寸过大、限制其AAV递送效率并阻碍临床转化的问题，研究人员开发了基于IS200/IS605转座子核酸酶TnpB及其ωRNA支架的增强型TnpB（enTnpB）紧凑型工具箱，用于基因激活、基因组编辑和碱基编辑。enTnpB可将基因表达提升最高2889倍，并成功激活CXCL9、IL-15、IFN-γ等免疫基因，所开发的AAV-ImmunAct疗法显著增强了T细胞迁移与活化，提升了杀伤能力，并能协同抗PD-1疗法，为癌症免疫治疗提供了前景广阔的新平台。
在生物医学研究的前沿，精准操控生命蓝图——基因组，是科学家们孜孜以求的目标。CRISPR-Cas系统，犹如一把分子剪刀，为基因编辑领域带来了革命，使得对特定DNA序列的精确修改成为可能。然而，这把“剪刀”本身却有个不小的“身材”问题。常见的Cas9蛋白个头较大，这使得将这套高效的编辑系统通过理想的递送工具——腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）——运送到靶细胞内部变得异常困难。AAV因其安全性高、免疫原性低而成为基因治疗领域的热门载体，但其有限的装载容量（约4.7 kb）与大部分Cas蛋白庞大的编码序列形成了尖锐矛盾。这一“装不下”的难题，如同一道瓶颈，严重限制了基于CRISPR-Cas的基因疗法，特别是那些需要复杂调控或多基因协同作用的癌症免疫疗法，从实验室走向临床病床的转化之路。
为了突破这一困境，科学家们将目光投向了自然界中更古老的基因编辑“遗迹”——IS200/IS605转座子家族。这个家族中的TnpB蛋白，被认为可能是CRISPR-Cas系统祖先的“精简版”，其编码序列显著短于Cas9。如果能够“唤醒”并优化这套更紧凑的系统，或许就能打造出既能高效调控基因，又能轻松搭乘AAV“快车”的全新工具。这正是本研究团队的核心出发点。他们瞄准了肿瘤免疫治疗领域，期望开发一种能够精准、高效激活患者体内免疫反应，从而对抗癌症的新型疗法。传统的癌症免疫疗法，如免疫检查点抑制剂（如抗PD-1抗体），虽然在部分患者中效果显著，但总体响应率仍有待提高。如果能从基因层面主动激活关键的免疫信号分子（如趋化因子、细胞因子），或许就能将“冷”肿瘤变为“热”肿瘤，增强免疫细胞的浸润和杀伤能力，并与现有疗法产生协同效应。然而，实现这一目标的前提是，必须有一套能够安全、高效、可递送地激活多个内源免疫基因的工具箱。
基于上述背景，由[作者名]等研究人员在《Nature Communications》上发表的研究，开展了一项旨在开发微型、多功能基因组调控工具箱并评估其在免疫治疗中应用的研究。他们系统性地对来自IS200/IS605转座子的TnpB核酸酶及其指导RNA——ωRNA进行了工程化改造，创造出了增强型TnpB（enhanced TnpB, enTnpB）系统。研究不仅构建了用于基因激活（enTnpBa）、基因组编辑（enTnpBe）和碱基编辑（enTnpB-BE）的多种工具，还重点开发了基于单次AAV递送的免疫激活方案（AAV-ImmunAct），用于在体内特异性激活CXCL9、IL-15和IFN-γ等关键免疫基因。最终，他们证实了该平台在增强抗肿瘤免疫反应方面的巨大潜力。这项工作成功地将一个古老的细菌防御系统改造为适用于哺乳动物细胞的强大生物技术工具，为下一代基因治疗和细胞治疗提供了极具吸引力的紧凑型平台。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们对多种来源的TnpB蛋白及其ωRNA进行了系统的工程化改造和筛选，优化了蛋白质序列和RNA支架结构，以提升其在哺乳动物细胞中的活性和特异性。其次，他们构建了基于单AAV载体的递送系统（AAV-ImmunAct），用于包装并递送优化后的enTnpBa组件（包括蛋白和ωRNA表达盒）。在功能验证层面，研究采用了报告基因检测、内源基因转录激活分析、高通量测序评估脱靶效应等多种体外实验。最终，研究利用人源化小鼠肿瘤模型，通过流式细胞术分析肿瘤微环境免疫细胞浸润、细胞因子检测、肿瘤生长监测以及联合抗PD-1抗体治疗等实验，在体内综合评价了AAV-ImmunAct疗法的抗肿瘤效果与免疫调节功能。
研究结果
1. TnpB系统的工程化改造产生高效的基因组调控工具
研究人员首先从不同细菌中筛选了天然的TnpB系统，并在哺乳动物细胞中测试其激活报告基因的能力。通过对TnpB蛋白序列进行理性设计与突变，并同时优化其ωRNA支架（包括减少其长度至93个核苷酸），他们成功开发出了活性显著增强的enTnpB系统。其中，用于基因激活的版本enTnpBa，在报告基因实验中展现出高达2889倍的激活倍数，证明了其强大的转录激活能力。此外，研究还通过调整enTnpB的核酸酶结构域，成功构建了能够进行基因敲除（enTnpBe）和碱基编辑（enTnpB-BE）的变体，展示了该平台的多功能性。
2. enTnpBa能够高效激活内源基因并具备高特异性
接下来，研究团队测试了enTnpBa在人类细胞中激活内源性基因的能力。他们针对多个基因设计ωRNA，并成功实现了对包括CXCL9、IL-15、IFN-γ在内的免疫相关基因的高效转录激活。通过RNA测序（RNA-seq）分析，他们确认了基因激活的特异性，并发现enTnpBa引起的全基因组转录组变化极小，脱靶效应可控，表明其具有较高的靶向特异性，为治疗应用的安全性提供了初步依据。
3. 单AAV递送的enTnpBa系统在体外激活免疫反应
为了解决递送难题，研究人员构建了一个单AAV载体系统（AAV-ImmunAct），将enTnpBa及其ωRNA表达元件全部包装进去。在体外实验中，用该AAV载体转导人类细胞后，能够有效上调目标免疫基因（CXCL9, IL-15, IFN-γ）的表达。功能上，经AAV-ImmunAct处理的细胞上清能够显著促进T细胞的迁移（模拟CXCL9的趋化作用）和活化（模拟IL-15和IFN-γ的刺激作用），并能增强T细胞对多种癌细胞系以及来自结直肠癌患者的原代类器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）的杀伤能力。这些结果表明，AAV-ImmunAct方案在体外能有效重编程细胞，使其成为一个“免疫激活器”。
4. AAV-ImmunAct在体内抑制肿瘤生长并与抗PD-1疗法协同作用
最后，研究在携带人肿瘤细胞的人源化小鼠模型中进行了体内疗效评估。将AAV-ImmunAct直接注射到肿瘤内，可观察到肿瘤局部目标免疫基因的表达显著上调。这导致了肿瘤微环境中CD8+T细胞和自然杀伤（NK）细胞等效应免疫细胞浸润增加，而调节性T细胞（Treg）比例下降，表明免疫抑制环境得到改善。更重要的是，AAV-ImmunAct单药治疗就能显著抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期。当与临床使用的抗PD-1抗体联合使用时，展现了强大的协同效应，比任一单药治疗都更能有效控制肿瘤，甚至在一些小鼠中实现了肿瘤的完全消除。深入的免疫分析进一步证实，联合疗法大幅增强了肿瘤内效应免疫细胞的功能和增殖。
结论与讨论
本研究成功地挖掘并改造了古老的TnpB-ωRNA系统，将其打造成为一个尺寸紧凑、功能强大的基因组调控平台——enTnpB。该平台不仅解决了大型Cas蛋白难以通过AAV有效递送的关键瓶颈，还实现了从基因激活、基因敲除到碱基编辑的多重功能。特别地，研究聚焦于癌症治疗，所开发的单AAV递送免疫激活方案（AAV-ImmunAct）能够高效、特异地激活肿瘤微环境中的关键免疫信号通路。体内外实验一致证明，AAV-ImmunAct能够有效招募和激活免疫细胞，增强其对肿瘤的杀伤力，并与现有的免疫检查点阻断疗法产生显著的协同抗肿瘤效应。
这项工作的意义深远。首先，在工具开发层面，enTnpB系统以其微小尺寸（相较于CRISPR-Cas系统）和高度可编程性，为基因治疗领域提供了亟需的新一代递送友好型编辑工具，有望拓宽基因疗法的应用范围。其次，在疾病治疗层面，研究提供了一种全新的癌症免疫治疗策略：即通过体内基因调控主动“加热”肿瘤，而非仅仅解除免疫抑制。这种“主动激活”与“解除抑制”相结合的方案，可能为对现有免疫疗法不响应的患者提供新的希望。最后，这项研究也展示了从基础生物学发现（古细菌转座子系统）到生物技术创新，再到临床前疾病模型验证的完整转化研究链条。尽管在迈向临床前，其长期安全性、递送效率的优化以及在不同癌种中的普适性仍需进一步探索，但本研究无疑为下一代精准免疫治疗开辟了一条富有前景的新路径。
