GmAGL6基因调控大豆 (Glycine max) 的花部比例和种子大小而非龙骨瓣特征

《Plants》：GmAGL6 Genes Regulate Floral Proportion and Seed Size Rather than Keel Petal Identity in Soybean (Glycine max) Haoming Zhai, Yezhou Liu, Meng Xia, Liwen Tang, Siyuan Zheng, Liangsheng Zhang and Dan Chen

　　

AGL6 (AGAMOUS-Like 6) 基因是多种被子植物中关键的成花调控因子，但其在豆科植物中的作用仍知之甚少。本研究旨在鉴定大豆 (Glycine max [L.] Merr. cv. Williams 82) 中的GmAGL6基因。研究人员鉴定了四个同源基因 (GmAGL6a–d)，它们具有保守的MADS-box和K-box结构域，并在AGL6谱系内聚集。组织特异性表达谱分析揭示了这些基因在花芽分化和成熟期转录本显著富集。利用CRISPR/Cas9技术，研究人员创制了四重敲除系以评估其功能。表型分析显示，与单子叶植物中AGL6缺失通常导致的同源异型转化不同，Gmagl6四重突变体保留了标准的蝶形花结构，且龙骨瓣没有发生畸变。然而，突变体的花高度和宽度没有显著变化，但花高宽比显著增加，成熟种子变小，而营养体结构和结荚能力未受影响。这些结果表明，大豆中的GmAGL6基因可能主要功能在于调控花部比例和种子发育，而非花器官特征。该研究为理解特化豆科花的演化提供了见解，并为改良种子大小提供了候选基因。

论文解读：GmAGL6基因在大豆花与种子发育中的功能解析

1. 研究背景与目的

被子植物花形态的惊人多样性是其演化的标志。经典的ABCDE花器官发育模型认为，MADS-box转录因子在此过程中扮演核心角色，其中AGAMOUS-Like 6 (AGL6) 家族在多种植物中被证明对花分生组织分化、器官特征和胚珠发育至关重要。在不同物种中，AGL6的功能存在多样性：在单子叶植物(如水稻、玉米)中，AGL6同源基因对于颖片、浆片、雄蕊和雌蕊的特征确定不可或缺，其突变常导致严重的同源异型转化；在双子叶植物(如矮牵牛、番茄)中，它参与花瓣和雄蕊发育，并与器官特征及单性结实相关。然而，在具有特化蝶形花结构的豆科植物中，AGL6的功能仍不清楚。豆科花的蝶形结构由旗瓣、翼瓣和融合的龙骨瓣组成，但调控其发育，特别是龙骨瓣特征的遗传网络尚不明确。尽管B类基因已知参与大豆花发育，但E类基因(特别是AGL6同源基因)在构建蝶形花中的作用尚未有报道。为了阐明AGL6在大豆中的功能，本研究系统鉴定并分析了GmAGL6基因家族，并通过CRISPR/Cas9基因编辑创制突变体，探究其在花器官形态建成、花部比例及种子发育中的具体作用。

2. 研究概述与意义

本研究以大豆品种Williams 82为材料，鉴定出四个GmAGL6同源基因 (GmAGL6a–d)，并通过系统发育、结构域和表达谱分析证实了它们属于保守的MIKC^c-型MADS-box家族。研究人员利用CRISPR/Cas9技术成功获得了GmAGL6的四重敲除突变体，并对突变体的花器官形态、营养生长、结荚及种子性状进行了系统的表型鉴定。研究发现，与单子叶植物中AGL6的功能不同，GmAGL6的缺失并未导致大豆花器官的同源异型转化或龙骨瓣特征丧失，而是显著影响了花部高宽比和种子大小。这一结果表明，在大豆中，AGL6谱系的功能可能从祖先的器官特征决定转向了调控生殖器官比例和种子发育，这为理解AGL6基因家族在被子植物中的功能分化以及豆科特化花结构的演化机制提供了新的视角。鉴于种子大小是大豆产量的关键决定因素，该研究也为大豆遗传改良提供了潜在的候选基因。本研究成果发表在学术期刊《Plants》上。

3. 关键技术方法

为开展研究，研究人员综合运用了生物信息学、分子生物学和遗传学方法。首先，利用兰花的OAGL6-2蛋白序列，通过HMMER对包括大豆在内的18个代表性物种的基因组进行同源性筛选，结合SMART数据库进行结构域预测，鉴定出大豆中的四个GmAGL6候选基因。利用最大似然法构建了AGL6基因家族的系统发育树，并通过Soybean Omics数据库 (SoyOD) 获取了这些基因在Williams 82品种不同组织器官中的表达谱数据。在功能验证方面，针对四个GmAGL6基因设计了特异的sgRNA靶点，构建了多靶点CRISPR/Cas9编辑载体，并通过农杆菌介导的转化方法，将载体导入大豆品种Williams 82，成功获得了T0代四重突变体株系。对突变体后代的基因型通过靶点区域的Sanger测序进行验证，确保了突变的纯合与稳定。表型分析则通过体视显微镜观察和ImageJ软件测量，定量比较了野生型与突变体在花高度、宽度、高宽比以及种子长度、宽度和百粒重等方面的差异，并进行了统计学分析。

4. 研究结果

4.1. AGL6基因家族的系统发育与结构特征

研究人员构建了包含98个AGL6同源蛋白的最大似然系统发育树，结果显示所有候选基因清晰地分为7个进化枝。结构域和基序预测证实所有同源基因均包含MADS-box和K-box这两个MIKC^c-型蛋白的标志性结构域，以及四个保守基序，表明该家族在进化上具有高度的结构保守性。

4.2. 候选GmAGL6基因的鉴定与系统发育分类

从上述系统发育树中聚焦AGL6核心谱系(第7枝)进行分析，发现四个大豆基因 (Glyma.09G266400, Glyma.18G224300, Glyma.03G019400, Glyma.07G081300) 与兰花的OAGL6-2聚集在一个高支持度的单系群中，因此将它们命名为GmAGL6a–d。表达谱热图显示，这四个基因在营养器官中表达量极低或完全沉默，而在花芽发育的多个亚时期显著富集，呈现出花特异性表达模式，这与其潜在的花发育功能一致。

4.3. CRISPR/Cas9介导的大豆AGL6四重突变体的创制与鉴定

研究人员为四个GmAGL6基因设计了八个sgRNA靶点(位于MADS-box或K-box结构域)，构建了多靶点编辑载体并转化大豆，获得了三个独立的T0代四重突变体株系 (Gmagl6-1, Gmagl6-2, Gmagl6-3)。测序证实了编辑事件发生在PAM序列上游。其中，Gmagl6-1株系的种子完全不能萌发，Gmagl6-2株系在T1代部分位点恢复为野生型，因此后续表型分析主要使用Gmagl6-3株系的T2代纯合群体。基因型分析证实了该群体在四个同源位点均为稳定的纯合突变。

4.4. Gmagl6四重突变体对大豆花器官形态的影响

表型观察发现，Gmagl6突变体保持了完整的蝶形花结构，包括旗瓣、翼瓣和融合的龙骨瓣，花器官数量、空间排列及龙骨瓣的融合与对称性均未发生改变，表明GmAGL6的缺失并未破坏花器官的基本结构特征。定量测量结果显示，突变体与野生型在花高度和花宽度上无显著差异，但花高宽比显著高于野生型。这表明GmAGL6突变主要影响花的比例而非整体大小。

4.5. GmAGL6四重突变体对营养生长、结荚和种子性状的影响

在营养生长阶段，突变体在株高、分枝和叶片形态等方面与野生型无显著差异。在生殖发育后期，突变体能够正常开花授粉并形成形态正常的豆荚，结荚能力未受影响。然而，突变体的成熟种子大小显著小于野生型，表现为种子总长、总宽以及百粒重的系统性降低。

5. 讨论与结论

5.1. 讨论要点总结

研究讨论部分从多个角度对结果进行了解读。首先，从进化与结构视角看，GmAGL6a–d具有保守的MIKC^c-型结构，其花特异性表达模式与其它被子植物中的AGL6同源基因一致，表明它们参与了大豆花发育的复杂调控网络。然而，其表型效应(影响花比例和种子大小而非器官特征)暗示该谱系在豆科中可能发生了功能特化。

其次，关于花器官特征的功能冗余与分化，研究表明，尽管GmAGL6与兰花OAGL6-2同源性高，但四重突变体并未出现预期的龙骨瓣特征丧失或同源异型转化。这可能源于两方面原因：一是功能冗余，大豆作为古多倍体作物，其基因组中存在大量重复基因，其他MADS-box基因(如GmSEP-like成员)可能补偿了GmAGL6的功能缺失以维持基本的花器官特征；二是功能分化，AGL6在双子叶植物中的核心作用可能已从“器官特征决定”转变为“发育过程微调”。

再者，研究聚焦于GmAGL6对花部比例和种子大小的影响。最显著的表型是种子变小和花高宽比增加，而花高和花宽本身无变化。这表明GmAGL6可能调控花部比例而非绝对大小，并在种子发育中扮演更明显的角色。这与拟南芥和蜡梅中AGL6-like基因影响细胞分裂、器官扩张和开花时间的报道一致。Gmagl6-1株系种子不能萌发的现象，提示GmAGL6c和GmAGL6d的MADS-box结构域完整性可能对种子萌发至关重要。

最后，研究人员提出GmAGL6作为花部比例和种子大小的数量调控因子。在单子叶植物(如水稻、兰花)中，AGL6同源基因的缺失通常导致同源异型转化或特化器官(如唇瓣)的丧失。而在大豆的蝶形花中，GmAGL6似乎被征用为调控花部比例和种子发育的数量性状基因，这反映了其在豆科进化中的功能分歧。

5.2. 研究结论翻译

总而言之，本研究鉴定并表征了大豆基因组中的四个AGL6同源基因(GmAGL6a–d)。系统发育和结构分析证实这些成员属于高度保守的MIKC^c-型MADS-box家族，并在大豆花芽分化和器官成熟期表达富集。利用CRISPR/Cas9介导的四重突变体群体(Gmagl6)进行的功能验证揭示，与在水稻和兰花等单子叶植物中观察到的同源异型转化不同，GmAGL6在大豆特化的蝶形花中并不主要决定花器官特征。相反，该基因家族可能有助于调控花部比例和种子大小。

这些发现表明，AGL6谱系在被子植物进化过程中经历了显著的功能分化。在豆科植物中，其作用似乎已从祖先的器官特征决定转向调控花部比例和种子发育。鉴于种子大小是大豆产量的关键决定因素，我们的研究结果为理解特化豆科花的发育机制提供了新的进化视角，并表明GmAGL6可能成为大豆遗传改良的潜在候选位点。