伏安指纹图谱分析与化学计量学：一种快速可靠的丁香花蕾真伪鉴定及掺假检测技术 Shelly Hafira Nikma, Budi Riza Putra, Mohamad Rafi, Eti Rohaeti, Munawar Khalil, Wulan Tri Wahyuni

《Chemosensors》：Voltammetric Fingerprinting and Chemometrics: A Rapid and Robust Platform for Ground Clove Bud Authentication and Adulteration Detection Shelly Hafira Nikma, Budi Riza Putra, Mohamad Rafi, Eti Rohaeti, Munawar Khalil and Wulan Tri Wahyuni

　　摘要：用更便宜的材料（如丁香茎和土壤）掺假丁香花蕾对香料的质量和消费者的信任构成了重大威胁。本研究介绍了一种新的替代分析方法，用于鉴定和检测丁香花蕾样品中的掺假情况。该方法结合了使用多壁碳纳米管修饰电极的伏安指纹图谱技术和稳健的化学计量分析。对丁香花蕾样品进行循环伏安分析时，在+0.5 V以上出现了阳极峰，在+0.5至-0.3 V之间出现了较小的阴极峰，这表明存在电活性化合物。从印度尼西亚三个主要生产地区（南苏拉威西、北马鲁古和东爪哇）采集的真正丁香花蕾样品的伏安图显示出不同的氧化还原峰强度。通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）成功地区分了不同来源的丁香花蕾样品，而主成分分析（PCA）则用于区分真正的丁香花蕾样品和掺假品。此外，偏最小二乘回归（PLSR）被用来量化掺假程度，利用电化学信号强度预测掺假物的浓度（10–100% w/w）。PLSR方法表现出观察值和预测值之间的强线性，证实了其稳健性。这种提出的方法为丁香花蕾的质量控制提供了一种简单、便携且实用的方法。快速伏安测量与化学计量建模的结合为防止欺诈和确保香料贸易的完整性提供了有价值的实用工具。

1. 引言
丁香（Syzygium aromaticum）花蕾具有巨大的经济价值，印度尼西亚是全球第二大出口国，2023年的出口额为9960万美元，为全球香料贸易带来了可观的收入[1]。鉴于这一重要的市场地位，保持印度尼西亚丁香花蕾产品的质量和真实性对于建立消费者信任和维持高贸易量至关重要。掺假是对这种完整性的重大威胁，尤其是在丁香花蕾中尤为普遍。为了追求更高的利润，不道德的生产商经常将丁香与更便宜的外国材料（如土壤、丁香茎、面粉、锯末、木瓜籽、玉米淀粉、咖啡壳或叶子）混合[2]。这种欺诈行为不仅降低了产品质量，对消费者构成了潜在的经济和健康风险，还严重损害了印度尼西亚丁香花蕾在全球市场上的声誉，导致收入大幅损失。这些负面后果凸显了迫切需要快速、准确且成本效益高的分析方法来检测和防止丁香花蕾的掺假。丁香花蕾的深远价值不仅在于其芳香品质，还在于其丰富的生物活性化合物组成，尤其是丁香酚（含量可高达95%）、乙酰丁香酚、β-石竹烯、水杨酸甲酯、蒎烯和香草醛[3]。这些植物化学物质具有广泛认可的治疗效果，包括抗菌[4]、抗氧化[5]、抗真菌[6]、抗病毒[7]、抗癌[8]、解毒[9]和抗炎[10]作用。因此，丁香花蕾在食品和饮料、制药、化妆品和烟草等行业中非常受欢迎，显著推动了市场需求[11]。鉴于其广泛的应用及其化合物的健康影响，鉴定和检测掺假至关重要。一个常见的问题是使用类似丁香花蕾但对消费者健康构成重大风险的掺假物，如土壤。另一种可能的掺假物是丁香茎，其丁香酚含量低于丁香花蕾[12]。虽然不会对健康构成风险，但在丁香花蕾中添加丁香茎是不可接受的，因为它侵犯了消费者获得真实产品的权利。尽管已经采用了高效液相色谱[13]、各种光谱方法（如拉曼[14]、傅里叶变换红外[15]和近红外光谱[16]以及质谱[17]等传统且高度精确的分析技术来评估丁香花蕾的质量，但这些方法通常需要复杂的样品预处理和非便携式仪器[18]。为了满足对可访问质量控制的迫切需求，电化学传感器方法提供了一个有吸引力的替代方案，其特点是简单、成本效益高、便携且样品制备要求低[19]。

为了克服传统方法的局限性并建立更易于访问的质量控制系统，我们提出了一种结合电化学传感器和化学计量学的新方法来分析丁香花蕾。虽然标准电化学传感器因其简单性而广泛使用（采用三电极系统），但在复杂基质（如丁香花蕾）中的应用往往受到灵敏度低的限制。为了显著提高分析性能，工作电极被策略性地修饰了多壁碳纳米管（MWCNTs）。选择MWCNTs是因为它们具有优异的特性，包括优异的电导率、巨大的表面积和高机械强度，非常适合放大电化学信号[20]。这种材料已被用于涉及铀酰[21]、儿茶酚[22]、Cu(II)[23]、多巴胺[24]、锑(III)[25]、日落黄和酒石黄[26]、西替利嗪二盐酸盐[27]和1-羟基芘[28]的各种电化学研究。尽管MWCNTs在传感多种化合物方面取得了成功应用，但它们与伏安指纹图谱技术和化学计量分析的结合尚未用于特定挑战——丁香花蕾掺假的检测。这种组合策略利用伏安法的优势生成反映丁香花蕾样品独特氧化还原行为的独特“指纹”。同时，化学计量学被用来解码这些复杂模式，从而实现掺假的鉴定和定量预测。尽管这种强大的电化学-化学计量范式在包括牛奶[29,30,31]、葡萄酒[32]、蜂胶[33]、咖啡[34]、橄榄油[35]和苹果汁[36]等多种产品的质量控制中已被证明有效，但其应用于丁香花蕾质量保证仍是一个令人兴奋且正在探索的前沿领域。

基于对可访问和准确的质量控制的公认需求，本研究介绍了一种基于伏安法的新型传感器，用于快速鉴定和检测丁香花蕾中的掺假。我们使用循环伏安法（CV）从纯丁香花蕾和掺假丁香花蕾样品中生成独特的伏安指纹图谱。然后对这些电化学谱图进行严格的化学计量分析以提取有意义的信息。对于基于地理来源（南苏拉威西、北马鲁古、东爪哇）的样品鉴定，我们采用了无监督的主成分分析（PCA）技术，该技术擅长降低数据维度[37]，以及有监督的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）以改善可视化和特征提取[38]。PCA和PLS-DA被用来区分真正的丁香花蕾和掺假品。此外，层次聚类分析（HCA）被用来区分纯丁香花蕾和掺假丁香花蕾。偏最小二乘回归（PLSR）这种有监督的多变量方法被用来预测掺假的定量百分比[39]。通过结合电化学测量的速度和这些化学计量工具的预测能力，这项研究提供了一种实用、高效且综合的解决方案，超越了单一掺假物的研究[40,41]。这种稳健的结合方法为确保全球香料行业中产品的真实性和质量提供了可行的现代途径。

2. 材料与方法
2.1. 试剂
除非另有说明，所有使用的试剂均为分析级。试剂包括多壁碳纳米管（MWCNTs）（Merck Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、乙醇（Merck Sigma Aldrich，德国达姆施塔特）、二甲亚砜（DMF）（Merck Sigma Aldrich，德国达姆施塔特）和氯化钾（KCl）（HiMedia，印度孟买）。实验过程中使用去离子水。
2.2. 样品制备
丁香花蕾样品从三个地区的当地农民处购买：南苏拉威西、北马鲁古和东爪哇。这些地区占印度尼西亚丁香花蕾产量的大部分，供应商保证其产品的质量。样品储存在室温下。进行伏安分析时，使用研磨机将丁香花蕾细磨。将2克磨碎的样品转移到采样小瓶中，加入10毫升50%（v/v）的乙醇去离子水溶液。剧烈摇晃直至获得均匀悬浮液。密封小瓶并在超声浴中提取15分钟。收集上清液用于后续分析。对于鉴定分析，对每个地区的丁香花蕾分别进行测量。为了量化目的，选择了丁香茎和土壤作为掺假物。通过混合三个地区的丁香花蕾等体积来制备复合丁香花蕾样品。通过将复合丁香花蕾与不同重量/重量（w/w）比例的掺假物混合来制备掺假丁香花蕾样品：0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%和100%。
2.3. 仪器
使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和X射线光电子能谱（XPS）对MWCNTs进行了表征。FTIR光谱在KBr颗粒上使用Nicolet-Protege 460光谱仪（Thermo-Nicolet，美国威斯康星州麦迪逊）在4000–6000 cm?1范围内记录。拉曼光谱使用LabRAM HR Evolution系统（HORIBA，法国朗茹莫）获得，激光波长为532 nm，光栅为1800 mm?1，物镜为100×。SEM分析使用JEOL JSM-IT200A/LA（JEOL Ltd.，日本东京）在15 kV下进行，而TEM分析使用Tecnai G2-20S Twin显微镜（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行。XPS分析在Kratos AXIS Supra+系统（Kratos Analytical Ltd.，英国曼彻斯特）上进行。所有电化学测量使用PalmSens4电位计（4272307054120）（PalmSens，荷兰豪滕）进行，通过USB连接到个人计算机，并使用PS Trace 5.10软件操作。设置包括一个玻璃碳电极（GCE，直径3 mm）作为工作电极，一个Ag/AgCl参比电极，以及一个铂丝作为辅助电极。在每次测量之前和之间，工作电极用0.1 μm氧化铝悬浮液在水中的溶液抛光，并用去离子水冲洗。
2.4. 分析程序
GCE通过滴涂4 μL 1 mg/mL MWCNTs在DMF中修饰并在100 °C下干燥。在–1至+1 V的电位范围内记录伏安图谱，扫描速率为20 mV/s，电位步长为5 mV[29,30]。所有测量在28 ± 1 °C的室温实验室条件下进行，无需预先脱气。伏安分析遵循Nikma等人[31]概述的程序。将5毫升样品放入电化学池中，加入5毫升0.2 M KCl溶液在蒸馏水中，搅拌直至获得均匀溶液。然后将制备好的溶液转移到电化学池中，所有电极连接到PalmSens4电位计上进行伏安测量。对于每个地区和每个掺假水平，样品的测量重复八次。
2.5. 统计分析
使用The Unscrambler X 10.1软件（CAMO，挪威特隆赫姆）进行多变量分析，包括PCA、PLS-DA和PLSR，使用Orange 3.40.0软件（斯洛文尼亚卢布尔雅那大学）进行HCA。PCA作为无监督方法应用，而PLS-DA作为有监督方法用于根据来源区分样品。HCA作为无监督方法用于区分纯丁香花蕾和掺假丁香花蕾。另一方面，PLSR用于量化掺假程度，以丁香茎或土壤的百分比（w/w）作为Y变量。数据集包括七个掺假水平，包括纯丁香花蕾（0%掺假）和掺假物。使用多个指标评估PLSR模型的性能。决定系数（R2）用于评估拟合优度，而校准均方根误差（RMSEC）和交叉验证均方根误差（RMSECV）用于评估模型稳健性。这些综合方法为丁香花蕾样品中的掺假分类和定量提供了全面的分析。

3. 结果与讨论
3.1. MWCNTs的表征
MWCNTs的FTIR光谱（图1a）显示了几条与石墨结构和表面官能团相关的特征吸收带。3432 cm?1处的宽带对应于O–H伸缩振动，可能来源于氧化处理过程中引入的羟基官能团或吸附的水分。1621 cm?1处的带归属于C=C伸缩，证实了共轭石墨框架的存在。1386 cm?1处的峰归属于C–H振动，而1093 cm?1处的吸收对应于C–O伸缩，表明存在含氧官能团，如醇或醚。这些发现表明，尽管多壁碳纳米管（MWCNTs）保留了其内在的石墨骨架，但表面氧化基团的存在增强了它们的分散性、溶解度以及在电化学应用中与分析物的界面相互作用。图1：(a) MWCNTs的傅里叶变换红外光谱（FTIR）；(b) MWCNTs的拉曼光谱；(c) MWCNT表面的扫描电子显微镜（SEM）图像；(d) MWCNT表面的透射电子显微镜（TEM）图像；(e) MWCNTs的扫描电子衍射（SAED）图案；(f) 解卷积后的高分辨率C 1s和(g) O 1s X射线光电子能谱（XPS）光谱。在(f,g)图中，黑线代表实验XPS光谱，而彩色峰对应于拟合成分。“*”表示π–π跃迁中的反键态。MWCNTs的拉曼光谱（图1b）显示了三个明显的峰：D、G和2D。D峰位于1351 cm?1，反映了sp2碳晶格中的无序或结构缺陷。G峰位于1584 cm?1，对应于有序石墨晶格中sp2杂化碳原子的面内振动模式。2D峰位于2696 cm?1，是D峰的二阶泛音，提供了关于石墨烯层堆叠顺序和数量的见解[42]。这些峰的相对强度证实了多壁碳纳米管部分有序但含有缺陷的结构特征。MWCNTs的SEM显微图（图1c）显示了一个密集的、缠结的长纤维状纳米管网络，形成了类似意大利面的形态[43]。这些管子的直径相对均匀，没有大的聚集体或非晶碳沉积物的证据，证实了其高纯度。观察到的三维多孔结构表明其具有较大的表面积，这有利于提高电导率和电化学性能。MWCNTs的TEM图像（图1d）进一步证实了它们的管状形态以及多壁结构特有的同心石墨层。高分辨率TEM插图（图1e）显示了清晰的晶格条纹，层间距约为0.342 nm，对应于石墨的(002)反射面，从而证实了纳米管壁的晶体性质[44]。清晰的晶格条纹以及沿管轴的平行暗线进一步表明了其结构完整性和低水平的非晶碳杂质。选区电子衍射（SAED）分析揭示了六角形石墨晶格的特征性环状图案，对应于(002)、(101)、(004)、(110)和(201)平面，从而证实了MWCNTs的晶体结构。

使用XPS对MWCNTs上的官能团进行了表征，如图1f,g所示。在图1f中，C 1s光谱在285.08 eV和285.38 eV的结合能（BEs）处显示出明显的峰，分别对应于sp2和sp3杂化的碳原子。sp2杂化的碳形成了石墨蜂窝状晶格，而sp3杂化则来源于结构缺陷。另一个位于286.18 eV的峰归因于C–O键，另一个位于287.18 eV的峰表明存在C=O双键[45]。另一个位于291.88 eV的峰归因于羧基。O 1s光谱（图1g）进一步解卷积以获得详细信息。与氧相关的峰显示出化学位移，导致不对称的轮廓。最低的BE峰位于531.98 eV，对应于羟基。533.38 eV处的成分与单C–O键相关，而稍高的能量可能表明存在含有C=O的官能团[46]。大约534.48 eV处的小峰可能是由于物理吸附的水分子。

3.2. 丁香花的伏安图谱
来自南苏拉威西、北马鲁古和东爪哇的丁香花样品的循环伏安图（图2）显示出特征性的氧化还原特征，这主要是由于主要生物活性化合物丁香酚的氧化。在超过+0.5 V vs. Ag/AgCl的电位下，所有样品都显示出明显的阳极电流，这可能与羟基取代的芳香化合物（丁香酚）的氧化有关[47]。这被认为是由于丁香酚（A）被还原为4-烯丙基环己-3,5-二烯-1,2-二酮（B），涉及两个电子和两个质子的转移（方案1）。值得注意的是，南苏拉威西和东爪哇样品的峰强度（约400–450 μA）高于北马鲁古样品（约300 μA），这可能表明它们的电活性酚类化合物浓度较高或基质组成有所不同。在较低的电位窗口（–0.3 V至+0.5 V）内，观察到还原峰的位置和形状有明显差异，反映了来自这三个地理区域的丁香花样品之间的组成差异。这些微妙的差异表明电化学响应不仅对浓度敏感，也对氧化还原活性化合物的具体组成敏感，包括次要的酚类、黄酮类和其他芳香代谢物。图2. 南苏拉威西、北马鲁古和东爪哇丁香花在0.2 M KCl中的循环伏安图。标记的转换（A）→（B）和（B）→（C）指的是方案1中提出的丁香酚的电化学氧化还原反应。方案1. 提出的丁香酚电化学氧化还原反应：(A) 丁香酚；(B) 4-烯丙基环己-3,5-二烯-1,2-二酮；(C) 4-烯丙基环己-3,5-二醇。从A到B的箭头表示氧化，而B和C之间的双箭头表示可逆的氧化还原过程。整体电化学行为的特点是主要的氧化电流，反向扫描时伴有微弱的阴极响应，这与天然酚类系统中常见的准不可逆电子转移过程一致，其中氧化产物（B）通过二次化学反应生成4-烯丙基环己-3,5-二醇（C），涉及两个电子和两个质子的转移（方案1）。因此，观察到的伏安图谱差异可以被视为来自不同来源的丁香花的独特电化学指纹。这样的指纹为鉴定提供了可靠且可重复的基础，通过化学计量建模可以实现基于地理来源的区分。这种方法突显了伏安法在捕捉由环境因素、栽培条件和采后处理引起的微妙化学变化方面的敏感性。

3.3. 伏安数据的多元分析
3.3.1. 丁香花地理来源的鉴定
进行了多元化学计量分析，包括无监督的PCA和有监督的PLS-DA，以基于地理来源鉴定丁香花样品。这些技术被应用于伏安图谱，以构建能够区分南苏拉威西、北马鲁古和东爪哇丁香花的分类模型。用于模型开发的变量包括从循环伏安图获得的电流强度值：所有记录的电流读数、正向和反向扫描期间的电流、–0.4至+1.0 V电位窗口内的电流，以及反向扫描中的相应还原电流。为了优化模型性能，评估了几种预处理技术，包括自动缩放[48]、均值归一化[49]、均值归一化结合自动缩放[50]、最大归一化[30]以及最大归一化结合自动缩放。预处理是化学计量建模中的关键步骤，因为它可以减少尺度差异、校正基线漂移，并增强次要但具有区分性的特征的相对贡献[51]。
PCA的预处理技术选择基于总PC和区分结果。相应的解释方差值总结在表S1中。预处理前后的PCA结果分别显示在图3a,b中。尽管累积解释方差达到了99%，但单独使用PCA无法完全区分三个丁香花组，因为它们的得分图显示出显著的重叠，表明它们的化学轮廓相似（图3a）。然而，当对反向扫描数据应用最大归一化结合自动缩放时，分离效果有所改善，总PC为91%，PC1（74%）和PC2（17%）（图3b），减少了南苏拉威西和东爪哇样品之间的重叠。检查了PC1和PC2的加载图（图S1），以确定负责区分丁香花样品的伏安变量。PC1解释了大约74%的总方差，在特定电位区域显示出最大的正负加载值，表明这些伏安变量对PCA得分图中观察到的分离贡献最大。这些有影响力的变量与丁香提取物中存在的电活性化合物（如酚类成分）的氧化还原过程相关的电化学信号有关。PC2解释了额外的17%的方差，显示出来自其他电位区域的次要加载贡献，表明其他伏安特征也影响样品之间的区分。特别是，这些变量有助于将北马鲁古样品与南苏拉威西和东爪哇样品区分开来，如PCA得分分布所示。考虑到这些变量对应于伏安测量的反向扫描（+1至?1 V vs. Ag/AgCl），一些有影响力的变量出现在大约+0.5 V以下的电位区域，这可能反映了丁香提取物中酚类化合物的电化学行为的变化。应当注意的是，由于伏安信号的连续性，相邻的伏安变量高度相关；因此，加载轮廓呈现为平滑曲线而不是孤立峰，反映了来自更广泛电位区域的贡献，而不是单一离散变量。然而，所得结果仍然没有显示出南苏拉威西和东爪哇丁香花之间的满意分组分离。这种部分重叠与它们相似的伏安响应一致（图2），表明它们的酚类组成相似。因此，需要进一步分析以实现更好的区分。

3.3.1. 丁香花地理来源的鉴定
进行了多元化学计量分析，包括无监督的PCA和有监督的PLS-DA，以基于地理来源鉴定丁香花样品。这些技术被应用于伏安图谱，以构建能够区分南苏拉威西、北马鲁古和东爪哇丁香花的分类模型。用于模型开发的变量包括从循环伏安图获得的电流强度值：所有记录的电流读数、正向和反向扫描期间的电流、–0.4至+1.0 V电位窗口内的电流，以及反向扫描中的相应还原电流。为了优化模型性能，评估了几种预处理技术，包括自动缩放[48]、均值归一化[49]、均值归一化结合自动缩放[50]、最大归一化[30]以及最大归一化结合自动缩放。预处理是化学计量建模中的关键步骤，因为它可以减少尺度差异、校正基线漂移，并增强次要但具有区分性的特征的相对贡献[51]。
PCA的预处理技术选择基于总PC和区分结果。相应的解释方差值总结在表S1中。预处理前后的PCA结果分别显示在图3a,b中。尽管累积解释方差达到了99%，但单独使用PCA无法完全区分三个丁香花组，因为它们的得分图显示出显著的重叠，表明它们的化学轮廓相似（图3a）。尽管如此，当对反向扫描数据应用最大归一化结合自动缩放时，分离效果有所改善，总PC为91%，PC1（74%）和PC2（17%）（图3b），减少了南苏拉威西和东爪哇样品之间的重叠。检查了PC1和PC2的加载图（图S1），以确定负责区分丁香样品的伏安变量。PC1解释了大约74%的总方差，在特定电位区域显示出最大的正负加载值，表明这些伏安变量对PCA得分图中观察到的分离贡献最大。这些有影响力的变量与丁香提取物中存在的电活性化合物的氧化还原过程相关的电化学信号有关。PC2解释了额外的17%的方差，显示出来自其他电位区域的次要加载贡献，表明其他伏安特征也影响样品之间的区分。特别是，这些变量有助于将北马鲁古样品与南苏拉威西和东爪哇样品区分开来，如PCA得分分布所示。考虑到这些变量对应于伏安测量的反向扫描（+1至?1 V vs. Ag/AgCl），一些有影响力的变量出现在大约+0.5 V以下的电位区域，这可能反映了丁香提取物中酚类化合物的电化学行为的变化。应当注意的是，由于伏安信号的连续性，相邻的伏安变量高度相关；因此，加载轮廓呈现为平滑曲线而不是孤立峰，反映了来自更广泛电位区域的贡献，而不是单一离散变量。然而，所得结果仍然没有显示出南苏拉威西和东爪哇丁香花之间的满意分组分离。这种部分重叠与它们相似的伏安响应一致（图2），表明它们的酚类组成相似。因此，需要进一步分析以实现更好的区分。

图3. 丁香花样品的PCA得分图（a）预处理前和（b）预处理后。圆圈用于直观显示每个样品组的聚类模式。为了改善分离效果，对循环伏安数据应用了有监督的PLS-DA。当对正向扫描电流数据应用均值归一化时，获得了最佳区分效果（图4b），与预处理前的不满意分离效果（图4a）形成对比。为了进一步研究负责监督区分的变量，检查了因子1和因子2的X加载轮廓（图S2）。因子1在PLS-DA模型中解释了最大的X方差比例，在电位窗口的边缘，特别是在接近+1 V vs. Ag/AgCl的高正电位区域显示出最大的加载幅度。这表明与氧化过程相关的伏安信号对区分不同地理来源的丁香花样品有很强的贡献。因子2显示出来自其他电位区域的额外贡献，包括在中等电位区域的适度负加载区域和在电位上限附近的强烈正贡献。这些模式表明，扫描过程中的多个伏安特征有助于区分不同地理组。如PCA模型中所观察到的，由于相邻伏安变量之间的强相关性，加载轮廓呈现为平滑曲线。这些结果突显了有监督方法（如PLS-DA）相对于无监督PCA的优越区分能力，特别是当结合适当的预处理策略以增强细微但特定于来源的电化学特征的贡献时。

图4. 丁香花样品的PLS-DA得分图（a）预处理前和（b）预处理后。圆圈用于直观显示每个样品组的聚类模式。表1总结了用于构建模型的训练集获得的结果。它展示了模型解释的X和Y矩阵的总方差比例，以及使用的组件数量。一个好的模型特征是残差方差低（接近0%）和解释方差高（接近100%），表明模型捕获了大部分方差[52]。校准方差代表模型在训练数据上的性能，而验证方差反映了其在未知样本上的性能。当校准方差和验证方差之间的差异较小时，表明模型泛化能力良好，且两个数据集代表了同一群体。表1. 分类模型测试中建立的七个因子的X和Y的总解释方差。在本研究中，验证方差与校准残差方差紧密匹配，表明模型能够有效预测新数据，并且表现出最小的过拟合。图4b进一步表明了模型的良好构建。得分图清楚地显示了来自不同地区的丁香花之间的分离。因子1的值为77%，因子2的值为12%；两者加起来接近最大值100%，如表1所示。在这项研究中，PCA和PLS-DA从伏安信号的不同部分获得了最佳的类别区分能力。PCA从反向电位下的电流数据中得到了最佳模型，而PLS-DA则从前向电位下的电流数据中得到了最佳模型。这种差异反映了无监督和有监督化学计量方法的根本不同目标。PCA识别预测矩阵中总方差最大的方向，而不考虑类别归属[53]。因此，反向扫描中的任何显著内在变化，例如更大的基线偏移、主导的氧化还原过程或更高的信号异质性，都会被强调出来，并可能产生更清晰的群体趋势。相比之下，PLS-DA提取的潜在变量最大化了伏安信号与类别标签之间的协方差，使其能够突出那些可能不会主导整体方差的微妙但特定于类别的特征[54]。因此，即使是在前向扫描中主要出现的低方差特征，如果与样本身份有更强的相关性，也能产生更好的区分效果。这些发现表明，与分类最相关的信息不一定与驱动全局方差的信息相同，前向和反向扫描可以包含互补的化学计量信息。这也强调了将无监督探索与有监督建模相结合以全面表征伏安数据区分潜力的重要性。

3.3.2. 辣椒芽与掺假物的区分
在使用PLS-DA成功鉴定出来自三个不同地理来源的辣椒芽后，我们进一步评估了这种化学计量方法区分真实辣椒芽和常见掺假物（即辣椒茎和土壤）的能力。用于按来源鉴定的相同数据集也被用于此目的，PCA应用于反向电位下的电流信号，而PLS-DA应用于前向电位下的电流信号。在测试的各种预处理策略中，最大标准化和自动缩放的组合产生了最明显的辣椒芽与掺假物之间的分离。在这些条件下，PCA应用于反向扫描的电流数据，而PLS-DA应用于前向扫描的电流数据。相应的PCA和PLS-DA得分图分别显示在图5a和图5b中。相比之下，尽管平均标准化为来源鉴定提供了最佳的PLS-DA性能，但在区分辣椒芽与掺假物的目标下，最大标准化与自动缩放的组合产生了更好的分离效果。这些观察结果表明，最佳预处理策略可能取决于分类目标。

图5. 预处理后的辣椒芽样本和掺假物的PCA得分图（a）和PLS-DA得分图（b）。圆圈用于直观显示聚类模式。PCA和PLS-DA的结果共同表明，基于循环伏安法的化学计量建模对于区分真实辣椒芽和掺假物材料是有效的，尽管未能实现来自不同地区的辣椒芽样本之间的完全分离。在PCA中，前两个主成分捕获的显著方差已经提供了辣椒芽和掺假物之间的清晰区分，表明掺假物的电化学特征与真实辣椒芽有显著不同。由于区域变异性通常会产生微妙的化学差异，这些差异可能无法被无监督方法完全捕捉到，因此不同地理来源的辣椒芽样本之间存在部分重叠是预期之中的。尽管PLS-DA是一种有监督的分类技术，但在这项研究中的表现与PCA没有显著差异。两种方法都显示出类似的聚类模式，辣椒芽始终与掺假物分开，而区域簇保持接近并部分重叠。这表明，即使没有有监督建模，辣椒芽和掺假物材料之间的内在伏安差异也足够明显，可以被检测到。因此，单独使用PCA似乎就足以检测掺假，因为它已经提供了真实辣椒材料与非辣椒污染物的精确可靠区分。

PCA和PLS-DA的相似表现进一步表明，对于这一特定分析任务，有监督建模仅提供了边际的额外区分能力，这可能是由于辣椒芽和掺假物之间的电化学行为存在强烈对比。总体而言，这些发现证实了循环伏安法结合基于PCA的化学计量分析提供了一种稳健、高效且复杂度最低的策略，用于识别辣椒芽样本中的掺假。

3.3.3. 辣椒芽与辣椒茎和土壤的掺假
HCA作为一种无监督的化学计量工具，被用来评估伏安指纹区分纯辣椒芽和掺假样品的能力。HCA清楚地显示了纯辣椒芽与掺假材料（辣椒茎和土壤）之间的区别。对于辣椒茎的掺假，HCA使用在?0.4至+1.0 V vs. Ag/AgCl氧化电位下记录的电流值进行，之前进行了平均标准化预处理。使用归一化曼哈顿距离和Ward链接方法构建了树状图。如图6所示，样品主要分为两个主要分支。纯辣椒芽形成了一个紧凑、定义明确的簇（C1），表明类内相似性高且伏安指纹独特。辣椒茎样本被单独分组（C2），证实了芽和茎的成分差异。掺假样品（10–80%茎）根据掺假程度分布在两个主要簇中，从辣椒芽簇逐渐过渡到茎簇。较低的掺假程度（例如10–30%）倾向于更接近辣椒芽组，而较高的程度（≥50–80%）则向茎簇移动。这种行为反映了辣椒芽和茎的植物化学成分相对相似，导致电化学特征部分重叠。

图6. 纯辣椒芽与掺有辣椒茎的混合物的HCA树状图，显示两个簇（C1–C2），其中C1和C2分别表示簇1–2。对于土壤掺假模型（图7），HCA使用最大标准化预处理后的所有记录电流值进行。距离使用归一化欧几里得距离计算，聚类使用Ward链接方法进行。结果树状图显示土壤样品形成了一个明显的簇（C1），与纯辣椒芽（C2）明显分开，显示出更强的区分能力。随着土壤含量的增加，掺假混合物再次显示出在簇之间的渐进迁移，较高比例的土壤（40–80%）形成了自己的子簇（C3–C6）。土壤掺假观察到更好的分离可能是由于土壤与植物来源的基质在物理化学和电活性性质上的根本不同，导致伏安曲线变化更为明显。

图7. 纯辣椒芽与掺有土壤的混合物的HCA树状图，显示六个簇（C1–C6），其中C1、C2、C3、C4、C5和C6分别表示簇1–6。总体而言，HCA成功区分了纯辣椒芽与两种掺假物，并揭示了浓度依赖的聚类趋势。然而，中间掺假程度之间的部分重叠表明，无监督聚类对于精确量化是有限的。因此，采用了下一节讨论的有监督回归方法（PLSR）来实现更准确的掺假预测。

PLSR是一种多变量回归技术，旨在建立两个矩阵之间的预测关系：预测变量（X）和响应变量（Y）。在本研究中，PLSR被用来量化磨碎辣椒芽样品中的掺假程度。X矩阵由循环伏安（CV）测量中提取的电流强度值组成，而Y矩阵代表掺假程度（辣椒茎/土壤与磨碎辣椒芽的混合百分比）。训练集中包括了九个掺假程度，每个程度有八个重复的CV测量（图S3）。在模型构建之前，对伏安指纹数据应用了各种预处理策略，以最小化基线偏移、标准化缩放差异，并增强次要但有信息量的电化学特征的贡献。在五个伏安数据集上评估的预处理方法总结在表S2和S3中。模型性能使用决定系数（R2）、校准均方根误差（RMSEC）和交叉验证均方根误差（RMSECV）进行评估。根据标准化学计量标准，最佳模型的R2值接近1，RMSEC和RMSECV值接近0。优化结果显示，对所有记录的电流数据应用平均标准化和自动缩放的组合产生了最佳的PLSR模型，用于检测辣椒茎的掺假。对于土壤掺假，对前向扫描电流数据进行自动缩放得到了最准确的PLSR模型。

应用上述优化预处理前后（图8和图9）的预测值与参考对照图显示了参考掺假程度与预测值之间的线性相关性，预处理后的模型表现有所改善。图8. 从PLSR模型获得的辣椒芽中辣椒茎的实际值与预测值之间的相关性（a）预处理前（b）预处理后。蓝点代表校准集，红点代表验证集。图9. 从PLSR模型获得的辣椒芽中土壤的实际值与预测值之间的相关性（a）预处理前（b）预处理后。蓝点代表校准集，红点代表验证集。具体来说，R2值增加，而RMSEC和RMSECV在预处理后降低（表2），对于辣椒茎和土壤掺假都是如此。这种改进强调了预处理在增强化学计量模型的稳健性和预测准确性方面的重要性。值得注意的是，PLSR模型展示了在整个测试范围内（高达100%）预测掺假的能力，证实了将伏安指纹与回归建模结合用于定量掺假分析的可行性。这些发现确立了PLSR作为辣椒芽鉴定的强大工具，不仅能够分类真实与掺假样品，还能准确估计掺假物的浓度。伏安法与PLSR的结合因此提供了一种快速、灵敏且便携的方法，用于实际环境中磨碎辣椒芽的质量控制。

4. 结论
开发了一种采用MWCNT修饰的GCE的伏安方法，用于检测辣椒芽与辣椒茎和土壤的掺假，结合了化学计量分析。该程序包括用MWCNT修饰电极，然后直接进行CV测量。获得的伏安数据经过预处理和多变量分析。PLS-DA成功区分了来自不同地区的辣椒芽样品；PCA区分了真实辣椒芽与掺假物（辣椒茎和土壤）；PLSR生成了一个稳健的预测模型。

补充材料
以下支持信息可以在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/chemosensors14040080/s1
表S1：不同地区辣椒芽样品PCA数据预处理的优化；图S1：从辣椒芽样品的伏安指纹中获得的PC1和PC2的加载图。这些图说明了不同电位下的电流值（伏安变量）对负责区分不同地理来源样品的主成分的贡献。
图S2：从应用于辣椒芽样品伏安指纹的PLS-DA模型中获得的因子1和因子2的X加载图。这些图表明了不同电位下的电流响应（伏安变量）对负责区分不同地理来源样品的潜在变量的贡献。
图S3：九个辣椒芽掺假浓度的循环伏安测量，每个浓度水平重复八次。表S2：辣椒芽与辣椒茎掺假的PLSR模型拟合优度参数。表S3：辣椒芽与土壤掺假的PLSR模型拟合优度参数。