综述：用于挥发性物质分析的二次电喷雾离子化质谱技术：当前面临的挑战与新兴解决方案 迭戈·加西亚-戈麦斯（Diego García-Gómez）、 安娜·巴列斯特-考德特（Ana Ballester-Caudet） 玛丽亚·埃斯特雷尔·费尔南德斯·拉埃斯帕达（María Esther Fernández Laespada）

《Analytica》：Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry for Volatile Analysis: Current Challenges and Emerging Solutions Diego García-Gómez, Ana Ballester-Caudet and María Esther Fernández Laespada

　　摘要：二次电喷雾离子化质谱（SESI-MS）已成为一种强大的技术，可用于实时、无创地分析复杂基质中的挥发性有机化合物（VOCs），例如呼出气体和微生物挥发组。然而，其在实际应用中的推广受到绝对定量、明确鉴定和标准化方面重大挑战的阻碍。本文全面概述了这些限制以及为克服它们而提出的解决方案。文章探讨了基质效应（包括气相离子抑制和C阱竞争），并介绍了诸如光谱拼接和标准添加等缓解策略。为了提高定量稳定性，还评估了先进的标准递送系统和动态质量控制协议。由于缺乏色谱分离，鉴定成为瓶颈问题，本文通过使用精心策划的数据库和先进的碎裂技术（如增量四极杆采集IQAROS）来解决同位素干扰问题。此外，还讨论了化学计量学在提取生物指纹中的作用。最后，强调了需要统一的报告标准和多中心验证以确保跨研究的可重复性。解决这些方法学问题对于SESI-MS在临床和工业领域的应用至关重要。

1. 引言
环境电离质谱（AIMS）是一组旨在在环境条件下直接分析样品的技术，即不在质谱仪的真空系统中进行[1,2]。在这种情况下，“环境电离”指的是样品制备在电离步骤附近实时完成，并在分析测量过程中进行。这种配置无需预先处理样品，相比传统分析方法具有显著优势。分析过程的即时性和简单性是AIMS的主要特点，而其他直接质谱方法通常需要在分析前进行样品调节和操作[3]。AIMS中最常用的电离技术基于大气电离，其中大气压化学电离（APCI）和电喷雾电离（ESI）应用最为广泛。后者由Fenn的研究小组在20世纪80年代末开发，证明了其能够电离大分子并生成气相离子，同时具有高灵敏度[4,5]。
电喷雾电离（ESI）是通过强电场使溶液形成带电微滴气溶胶，逐步脱溶和连续滴裂最终生成气相离子[4,5]。在经典ESI中，待分析物先溶解在液体溶剂中，然后在电喷雾过程中被电离；而在二次电喷雾电离（SESI）中——这一概念由Hill等人于1999年首次提出[6]——电喷雾主要用于从溶剂中生成试剂离子，待分析物本身并不存在于喷雾液中。相反，气相中的中性待分析物分子被引入电喷雾羽流中，在那里它们与喷雾产生的试剂离子发生离子-分子反应以实现电离。尽管SESI与其他大气压电离（API）源具有基本的电离原理，但其操作方式有所不同。为了帮助读者更好地理解，表1总结了SESI、ESI和APCI之间的关键差异，突出了各自的优点、分子量（MW）范围和极性偏好。图1简化展示了ESI和SESI电离技术。表1. ESI、APCI和SESI技术的比较。图1. 经典电喷雾电离（ESI）（A）和二次电喷雾电离（SESI）（B）的示意图。在ESI中，溶液中的待分析物直接喷雾并在电喷雾羽流中电离；在SESI中，气态待分析物通过加热毛细管引入，并在与预先形成的电喷雾羽流混合后电离。在大多数情况下，SESI与质量检测器结合使用，以分离和检测生成的离子[7]。根据具体应用和最终用户的需求，SESI可以与低分辨率仪器（如四极杆质谱仪QMS[8,9]）或高分辨率仪器结合使用。然而，高分辨率质谱（HRMS）比QMS具有更高的质量精度和分辨能力，已被应用于更多领域。使用HRMS分析仪（如Orbitrap或四极杆飞行时间（QTOF）时，仪器首先进行全扫描（MS1）以检测所有存在的离子，然后对最丰富的离子或预先选定的离子进行碎裂，以记录其MS/MS谱图。这有助于更准确地识别分子离子及其同位素模式——这一优势在非靶向研究中尤其宝贵。
SESI的速度、简单性和检测复杂基质中分析物的能力使其成为多种分析应用中的宝贵工具，包括与安全相关的挥发性化合物分析[10,11]、临床环境中呼出气体的研究[12,13]、食品工业的质量控制[14,15]，或微生物释放的挥发性有机化合物（VOCs）的研究[16]。SESI-MS能够实时无创地分析样品，已被证明可以检测样品中浓度极低的低挥发性化合物（分子量高达900 Da）以及非常极性的化合物[17]。然而，文献中记录的例子主要涉及低质量代谢物和挥发性物质。因此，SESI通常引用的质量上限反映了源-分析仪组合的技术能力，而不是大量实际应用的证据。
已有许多关于SESI-MS在各个领域分析应用的宝贵综述文章[7]，特别是关于呼吸分析[18,19]。SESI-MS也被纳入了关于呼出气体质谱分析的广泛文献综述中，作为一种重要的直接电离技术[20]。此外，Liao等人的里程碑式综述[21]最近巩固了对SESI机制的理解，弥合了其历史发展与当前仪器进步之间的差距。这项工作对该领域至关重要，因为它为SESI和EESI（提取电喷雾电离）的电离过程提供了全面的理论框架。它确定了影响电离效率的关键因素——如分析物质子亲和力、偶极矩以及源参数（如温度和流速），为克服痕量气体分析中的灵敏度和背景噪声限制提供了路线图。然而，对现有文献的批判性评估揭示了一个重要问题：大多数综述要么侧重于广泛应用调查，要么关注离子源的物理原理，往往忽略了阻碍SESI-MS向临床或工业常规应用过渡的实际方法学障碍。具体来说，缺乏针对绝对定量、在没有色谱分离的情况下明确化合物鉴定以及开发统一标准化协议这三个挑战的综合讨论。
本研究旨在通过提供当前挑战的全面概述，更重要的是提出克服这些挑战的解决方案，来解决这些问题。通过评估诸如光谱拼接以减轻离子竞争、使用增量四极杆采集IQAROS等先进碎裂技术来解决同位素干扰，以及实施多中心质量控制协议，本文为确保SESI-MS的成功应用所需的可重复性和可靠性提供了路线图。

2. 电离机制、仪器发展及SESI-MS信号特征
2.1. 电离机制
纯溶剂（如水）的电喷雾如何诱导气相分子电离的机制仍不完全清楚。主要争论集中在充电剂的性质上，即蒸汽如何带电。如图2所示，提出了两种机制[22]。
2.2. 仪器发展
20世纪90年代末，SESI仪器主要是实验室自制的：华盛顿州立大学的Hill团队开发了一种用于离子迁移谱/质谱（IMS-MS）的SESI源，展示了其对小分子的高电离效率，并概述了非法药物检测的性能指标[6]。21世纪，耶鲁大学Fernández de la Mora领导的实验室为商业质谱平台设计了SESI接口，并量化了爆炸性蒸汽的检测限和充电效率，达到万亿分之一的水平，从而定义了实际灵敏度和传输限制[11]。同时，苏黎世ETH大学（Zenobi团队与Sinues团队密切合作）开发了低流量SESI源，并将其应用于实时呼吸分析，确立了挥发组学作为一个可行的分析领域，并促进了临床应用[29]。随后这些学术原型实现了商业化。西班牙Valladolid的SEADM公司推出了低流量SESI模块（LFSESI/D-LFSESI）和差分迁移分析仪（DMA）耦合版本，提高了灵敏度，特别针对低挥发性分析和爆炸性痕量检测[30]。西班牙Madrid的Fossil Ion Tech公司推出了适用于Orbitrap系统的Super SESI系列，强调高温蒸汽处理、自动清洁和稳定的纳米电喷雾技术，2016年开始在临床和研究实验室中部署[31]。最近，中国也出现了供应商：Helius-3000是一种通过本地分销商销售的SESI源，A-HealthX（中国东莞）是开发者之一。除了源设备外，集成商如瑞士Rotkreuz的Deep Breath Intelligence现在也提供用于分散式临床使用的SESI-HRMS平台，反映了SESI生态系统的成熟[32]。
2.3. SESI-MS特征信号
SESI MS的主要分析输出是全扫描质谱图，代表了在一系列m/z值范围内检测到的离子的全面快照。这些谱图通常包含数百个峰，代表各种样品衍生的分析物或环境背景信号。电离通过质子转移或加合物形成实现，通常在正模式下产生[M + H]+或[M + NH4]+物种，在负模式下产生[M ? H]?或加合物（如[M + HCOO]?）。虽然许多应用侧重于正离子电离以检测碱性化合物，但负SESI同样稳健，广泛用于有机酸、脂肪酸和其他电负性物种的分析。由于缺乏色谱分离，所有离子信号同时出现，产生特征性的质谱模式，作为样品的化学指纹。此外，通常会对特定化合物的特征进行在线MS/MS实验以进一步确认。例如，图3展示了沙丁胺醇的实时SESI时间迹线、MS1谱图片段以及m/z 240的沙丁胺醇分子离子的MS/MS谱图。
3. SESI挑战
3.1. 定量
由于SESI的电离机制尚未完全理解，因此其分析需要相对定量。尽管使用为特定MS分析物准备的校准曲线仍可进行定量，但这仍然具有挑战性。前者[33,34]涉及使用来自商业气瓶的认证气体混合物，随后通过高精度质量流量控制器和高纯度载气（例如氮气或合成空气）进行稀释。后者[35,36]依赖于基于蒸发的系统，其中液体标准物被蒸发到连续的载气流中。这种方法在生成定制的多组分混合物方面提供了更大的灵活性，特别是对于那些不能以压缩气体形式商业获得的半挥发性或极性化合物。此外，SESI-MS的灵敏度在不同类别的VOCs之间存在显著差异，这对通用量化是一个主要障碍。这种差异主要由分析物的物理化学性质决定；具体来说，具有较高质子亲和力和较大偶极矩的分子在与电喷雾羽流中的反应离子相互作用时表现出更高的电离效率，因此灵敏度也更高[23]。这种类别依赖的响应意味着在没有特定校准的情况下，无法直接比较不同化学家族的信号强度，因此需要使用内标或针对每种目标化合物的详细校准曲线来获得准确的结果。

3.1.1. 基质效应/离子抑制
SESI-MS中的准确量化面临由基质效应引起的重大挑战，这种效应在传统的ESI方法中也很常见[37]，并且由于该技术的特性（直接气相电离而不进行色谱分离）而加剧。几项最近的研究证实，离子抑制——即由于气相中其他化合物的存在而导致某些化合物的电离效率降低——会显著影响灵敏度、重复性和结果的可靠性。在这方面，Wüthrich等人[38]评估了丙酮、氘代丙酮、氘代乙酸和吡啶的抑制能力，进行了不同的实验，其中一种化合物的浓度相对于其他化合物增加。结果表明，离子抑制主要由气相过程控制，吡啶显示出最强的抑制作用，这可能与其高气相碱性有关。此外，还使用氘代丙酮和呼出气体冷凝物评估了丙酮对呼出气体的离子抑制效应。当D6-丙酮的气相浓度增加到10 ppm时，冷凝物中挥发性组分的强度降低了大约50%。为了缓解这一问题，Wüthrich等人采取了在潮湿条件下操作的策略，通过加湿载气流来实现大约30%的离子抑制减少，尽管这可能会根据化合物的不同而影响灵敏度。另一种策略是用额外的气流稀释样品；然而，这也涉及灵敏度的权衡，因为对于含有超过1 ppm丙酮的呼吸样品，需要100倍的稀释才能将信号减少到20%。

标准添加方法通常用于定量分析中以解决基质效应，在SESI-HRMS在线呼吸分析中也进行了评估[39]。为此，作者使用了之前用于分析C2至C6挥发性短链脂肪酸的系统[35]。气体标准物在六个温度控制的蒸发室中制备，其中分析物的水溶液建立了一个由亨利定律描述的液-气平衡。为了评估这种方法，向三名志愿者的呼出气体中控制添加了吡啶和丁酸（从7到300 ppb）。尽管在个体内部和之间观察到了斜率的变异性，但所得浓度仍保持在同一数量级。有趣的是，研究指出，使用内标（D5-吡啶和D7-丁酸）以恒定浓度标准化信号实际上恶化了校准曲线的线性。此外，关于离子抑制，同一作者还测试了一种呼吸稀释方法来检查强度变化。他们发现，某些特征的强度在稀释后达到峰值，这种现象归因于较不碱性化合物的信号增强，因为更碱性的、具有抑制作用的化合物的浓度降低了。

3.1.2. 基质效应/离子竞争
除了离子抑制之外，Zenobi等人[40]还发现，当与SESI耦合的质量谱仪是Orbitrap时，实时监测基质丰富的样品（特别是人类呼吸和细菌培养物顶空）也会在分析仪的离子捕获区域（C-trap）产生离子竞争现象。因此，SESI-HRMS没有采用传统的程序，即单次扫描获取整个m/z范围，而是应用了一种称为光谱拼接的策略，其中单独获取较窄的、重叠的m/z窗口，然后组合起来。m/z窗口设置进行了优化（将m/z = 50–500范围分成4个窗口），以最小化SESI–Orbitrap MS系统中的离子竞争，同时不牺牲扫描速度，从而检测到三倍的特征数量。这种策略受到了纳米电喷雾电离（nESI）直接注入质谱法中使用的代谢组学和脂质组学工作流程的启发，旨在最小化电离抑制或增强效应[41]。

Zhu等人[42]在细菌顶空挥发组学的研究中也采用了光谱拼接技术。在这种情况下，除了减少来自密集分析物基质的离子竞争外，他们还利用了微生物挥发性有机化合物（mVOC）数据库[43]中记录的丰富细菌挥发物库，采用了一种称为数据库辅助全局优化靶向（dGOT）-SESI-HRMS的方法。这为检测到的m/z特征提供了另一种验证方法，以确认其化学身份。

3.1.3. 缺乏标准化
尽管SESI-HRMS方法今天被广泛使用，但它仍然缺乏量化和质量控制的标准化基准。为了解决这个问题，开发了一种可以同时输送多个VOC标准的气相标准输送系统，并在不同的SESI-HRMS设置中进行了评估，从而实现了常规的质量控制、仪器漂移的监测和技术异常值的检测[33]。为此，使用相同的设置评估了三种不同的标准输送系统，即SESI–Quadrupole Time of Flight（SESI-QTOF），获得了<10%的运行间变异性和更低的运行内变异性，证实了各单元之间的高度稳定和可重复性能。此外，每个标准输送系统都与相同的商业SESI离子源一起使用，该离子源连接到苏黎世大学医院（USZ）的Orbitrap分析仪以及苏黎世大学儿童医院的两个QTOF分析仪。在一个小时的测试期间，每10分钟引入一个七组分标准。总体而言，除了某些例外，运行间变异性与生物分析验证指南推荐的<15% CV一致。大多数标准的运行内变异性<20% CV，其中最高强度信号（m/z 137和m/z 155的1,8-桉叶油）在所有实验室中的表现最佳（<5% CV）；最差的运行内行为对应于低强度峰（二甲基硫化物和β-石竹烯）。

标准输送系统还连续几周应用于呼吸样品，证实了其监测仪器波动和定义呼出气体中技术异常值的适用性。作者建议将其常规纳入标准操作SESI-HRMS程序中。

在另一项多中心研究（巴塞尔、苏黎世和广州）中，也描述了数据收集和数据处理的标准化作为主要优先事项[44]，其中每天在采集呼吸样品之前进行质量控制程序，包括获取已知浓度的八组分气体混合物，并使用内部MATLAB应用程序（MATLAB版本2021a，MathWorks，Natick，MA，USA）随时间比较气体混合物的信号强度。多中心数据的比较显示技术变异性约为20%，这与基于质谱的代谢组学通常报告的变异性一致。

3.2. 识别和注释挑战
SESI-MS常规应用的最大障碍之一是难以实现明确的化合物识别。由于SESI-MS通常不提供色谱法提供的保留时间信息，因此得到的质谱图往往非常复杂，包含数百或数千个重叠的特征[7]。靶向和非靶向SESI-HRMS方法在范围和工作流程上有所不同。靶向协议专注于预定义的分析物列表，并经常使用并行反应监测（PRM）或选择性离子监测（SIM）进行量化和碎片化。相比之下，非靶向SESI-MS在宽m/z范围内获取全扫描谱图，并使用数据依赖的MS/MS捕获代表未知代谢物或挥发性有机化合物（VOCs）的数百个特征。在非靶向工作流程中，可靠的特征注释尤为重要，以便进行生物学或环境解释，因为它们缺乏靶向方法中标准提供的先验知识。

使用HR-MS进行化合物识别的信心可以使用Schymanski等人[45]提出的框架系统地进行分类，该框架分配了以下级别（总结在图4中）：级别1：确认的结构，通过MS1、MS/MS和保留时间匹配；级别2：可能的结构，通过MS1、MS/MS明确的库谱匹配或诊断证据；级别3：暂定的候选物，有一个或多个可能结构的支持证据，但MS1、MS/MS信息不足以分配单一的、明确的结构；级别4：确切的分子式，无论是否有MS/MS光谱信息以及提出可能结构的证据不足；级别5：确切的质量，由MS提供，但缺乏分配结构的信息。许多SESI-HRMS识别达到了级别2-4，但对于小分子，即使级别2也可能因缺乏支持性正交信息而出错[46]。以下小节概述了文献中确定的几个挑战以及提出的解决策略。

3.2.1. 解决同位素干扰
如前所述，在典型的DI-HRMS代谢组学工作流程中，样品在MS1级别进行分析，随后进行统计分析以获得感兴趣的MS1信号，然后在下一步将这些信号注释为化学结构。为了获得足够的信心，这一步骤需要通过串联质谱（MS/MS）进行表征。尽管高分辨率MS可以在MS1阶段区分仅相差几毫道尔的同位素化合物，但获得不同的MS/MS谱图要困难得多。这是因为同位素前体离子经常共同碎片化，导致它们的MS/MS谱图中相互干扰。在文献中，这种复杂的谱图通常被称为嵌合MS2谱图或嵌合体。

这个问题在基于液相色谱的蛋白质组学和代谢组学中也很常见[47]。在SESI-HRMS中，由于缺乏先前的分离，情况更加复杂，因为无法采用诸如改变色谱条件或建立与保留时间的相关性之类的解决方案。提出的一种解决方案是使用称为IQAROS[48]的方法（增量四极杆采集以解决重叠谱图），该方法使用由隔离四极杆与Orbitrap串联组成的MS设置。IQAROS通过逐步移动四极杆隔离窗口在前体的质量-电荷（m/z）范围内调节前体和片段的强度。然后通过线性回归模型对调节后的信号进行反卷积，以重建干扰较小的片段谱图。在这项工作中，使用六个模型同位素化合物（m/z范围在0.09内）评估了该方法的性能，这些化合物在MS1阶段是可分离的，但在MS2阶段共同碎片化：苯并噻唑、吡啶-2,6-二醛、3H-吡咯[2,3-d]嘧啶-4(7H)-酮、腺嘌呤、乙酰苯胺和N,N-二甲基苄胺。结果表明，IQAROS得到的片段谱图与纯标准物的谱图相当，或者在结构分配方面优于或可比于直接MS2分析。此外，IQAROS还用于人类呼吸中化合物的识别，其中检测到了两种同位素生物标志物（壬二酸和10-羟基癸酸），这与之前通过液相色谱与高分辨率质谱（LC-HRMS）确认其身份的研究一致[49]。作者承认，当许多前体被反卷积时会出现局限性，尽管可以使用更先进的统计方法来解决这个问题。**光谱数据库的使用**

早期通过SESI-HRMS检测挥发性及半挥发性分子的工作，严重依赖于大型、通用的化学和代谢物资源——例如自2004年在线的PubChem（用于结构和同义词查询[50]）、2007年正式推出的Human Metabolome Database（HMDB，用于人类相关的内源性代谢物[51]）、1995年成立的KEGG（用于生化背景信息[52]），以及大约在2005年建立的METLIN（用于实验性MS/MS参考光谱[53]）——因为这些资源提供了广泛的覆盖范围和可互操作的标识符，支持对m/z特征的初步注释。在将SESI-HRMS应用于直接呼吸分析（其关键应用之一）时，人们意识到呼吸组学需要专门的资源：这些资源包括经过整理的呼吸中报告的VOCs（挥发性有机化合物）的汇编、定量范围以及与疾病的关联信息，以减少来自普遍存在的环境污染物的假阳性结果。为此，社区和商业机构开发了以呼吸为中心的数据库——最著名的是2020年组装并发布的Human Breathomics Database（HBDB）[54]和2023年推出的Owlstone Medical的Breath Biopsy VOC Atlas[55]——这些数据库汇总了实际在呼出气体中观察到的化合物，并将其与文献证据、采样背景和流行率联系起来，从而提高了SESI-HRMS注释的可靠性。最后，开放的光谱库和光谱匹配平台（如MassBank/MoNA和传统的NIST库）仍然通过提供参考光谱在结构鉴定中发挥着重要作用，但自2010年代末以来，该领域的共识是，专门针对呼吸的、经过精心整理的数据库结合正交证据（生物学合理性、共洗脱或平行色谱确认以及受控的背景采样）对于将SESI-HRMS的特征转化为可靠的化合物鉴定至关重要。

**其他领域的应用**

除了以人类为中心的资源外，其他领域也可以利用数据库辅助的方法。例如，前面提到的微生物-VOC（mVOC）数据库[43]提供了一个专门用于细菌化学特征的存储库。这使得伪靶向方法成为可能，显著扩展了实时微生物挥发组学中低丰度代谢物的检测和鉴定范围。

**确认方法**

另一种提高SESI-HRMS注释水平并确认化合物鉴定的方法是进行额外的LC（液相色谱）或GC（气相色谱）分析。例如，在一项关于人类呼吸的比较分析中[56]，十六名参与者的呼出气体被浓缩后，通过动态顶空生成结合GC-HRMS以及在极性和反相条件下通过LC-HRMS进行了检测。大约25%的SESI特征与LC-MS和GC-MS有对应匹配，其中大部分重叠特征的质量范围在250 m/z到400 m/z之间。GC-MS实现了稳健的化合物鉴定，尽管只有少数化合物的NIST匹配因子高于80。虽然GC-MS和LC-MS方法都与SESI特征有部分重叠，但在150到200的质量电荷范围内重叠较少。总之，GC-MS和LC-MS对呼吸冷凝物的分析可以作为补充工具，用于注释SESI-MS获得的特征。然而，为了提高注释结果的可靠性，建议将这些方法与额外的在线碎片化技术结合使用。还有报道指出，使用超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）对呼出气体冷凝物进行分析[12]，通过比较保留时间和MS2光谱与商业标准来实现明确的化合物鉴定。

**跨研究变异性**

尽管光谱注释越来越可靠，且出现了以呼吸为中心的数据库，但将SESI-HRMS（及其他非靶向）的结果转化为临床有用的生物标志物仍面临一个持续存在的障碍，即不同研究中报告的化合物列表一致性较差。这个问题并非SESI-HRMS所特有；元分析和最近的综述显示，大量被报告为“显著”的代谢物或VOC实际上是特定于研究的，而非可重复的：例如，2024年的一项临床代谢组学元分析[57]报告称，约72%的被标记为显著的代谢物仅在一个研究中发现，这突显了该领域更广泛的可重复性危机。这种异质性源于多种相互作用的因素：生物学变异性（人群异质性、饮食、药物、昼夜节律效应）、分析前差异（禁食状态、采样的呼吸部分、环境空气控制）、分析平台效应（SESI-HRMS与GC-MS或LC-MS、电离条件、质量分辨率和质量校准），以及不同的数据处理/统计工作流程（特征过滤、标准化、多重检验处理和模型选择）[58]。这些因素共同作用，当研究之间没有协调时，会将小规模的队列信号放大为看似不同的“生物标志物”列表。这些问题在呼吸组学中尤为突出，因为呼出的VOC谱型高度动态且容易受到采样技术和环境污染的影响，但跨研究的一致性缺乏并非呼吸组学所独有：系统综述和代谢组学领域的总结反复呼吁采用标准化协议、更大的多中心队列以及正交验证（例如，平行GC-HRMS或LC-HRMS确认、靶向定量），才能使SESI-HRMS的特征转化为可靠的化合物鉴定。

**结论**

为了应对有限的可重复性和跨研究可比性问题，已经提出了几种报告检查清单和最小信息框架，并越来越多地推荐用于呼吸组学和SESI-HRMS研究。在代谢组学层面，2007年首次提出的Metabolomics Standards Initiative（MSI）定义了实验设计、样本处理、分析方法和代谢物鉴定置信度的最低报告要求，提供了一个共同的语言来区分确认的鉴定和推测性注释[59]。这些原则在后来的共识论文和综述中得到了重申和细化，强调了透明报告分析前变量、仪器设置、数据处理流程和统计方法是跨队列和平台进行有意义比较的先决条件。对于临床导向的呼吸研究，更广泛的诊断报告指南如STARD（Standards for Reporting Diagnostic Accuracy Studies）[60]也被越来越多地引用为补充框架，因为它们强制要求明确描述研究人群、参考标准和偏差来源。特别是对于呼吸研究，最近的综述[61,62]强调，特定于呼吸的混杂因素（如短暂暴露、呼吸模式和环境背景校正）以及在线采样与离线采样的差异解释了研究间的不一致性，并建议明确报告分析前和仪器参数以提高可比性。Singh等人的工作[63]就是一个例子，他们制定了SESI-HRMS呼吸分析的标准程序，作者建议明确报告分析前（如操作细节、禁食状态）、仪器（如SESI压力、温度）和质量控制参数（如气体标准），以提高研究间的可比性。作者还开发了一个新的接口（Exhalion），该接口测量CO2和其他参数以指导呼气操作，实现了所研究的27种醛类的6.7%中位CV（变异系数），远低于个体间变异（48.2%），从而得出结论：所描述的呼吸分析和程序符合在多中心临床研究中进行呼吸代谢组学研究所需的标准。

**化学计量工具**

SESI-HRMS已被广泛证明是一种强大的技术，可用于快速、实时分析复杂的挥发性混合物，特别是在生物学和临床环境中，而无需色谱分离。许多SESI-HRMS研究不是依赖于单个化合物的明确鉴定或异构物种的分辨，而是利用由多种挥发性有机化合物（VOCs）共同贡献产生的全局挥发性指纹图谱。为此，由于涉及大量数据集，需要先进的数据处理（化学计量学）。已经发表了使用多变量统计方法对样本组进行稳健分类和区分的研究，在许多情况下几乎不需要化合物级别的注释。表3展示了几个代表性示例，突出了目标分析物、化学计量工具以及取得的成果。这些方法成功地区分了细菌种类、细菌性肺部感染或癌细胞与正常细胞，以及利古里亚橄榄油与非利古里亚橄榄油的区别，以及食品产品的成熟阶段。

**总结**

尽管SESI-HRMS是一项相对较新的技术，但过去二十年的大量研究和应用——加上来自不同制造商的商业仪器的可用性——反映了其日益成熟。尽管如此，它在特征注释和定量方面仍面临挑战。在这篇综述中，讨论了几种为解决这些问题而开发的方法。应进一步开展工作，开发能够在受控流量和湿度条件下生成稳健气相浓度的标准输送系统，即使对于低挥发性化合物也能实现ppb级别的定量，从而能够评估线性、检测限和定量限（LOD/LOQ），以及在各种条件下的信号稳定性（如湿度变化或竞争化合物的存在）。在这方面，建议使用气相标准对每类感兴趣的化合物进行离子抑制研究，同时系统地改变抑制剂的浓度。这将有助于定义安全的定量范围，并对问题化合物发出警告。SESI-HRMS用户社区应合作定义气相参考材料、具有严格采样条件控制的通用分析程序（气体流量、湿度和载气组成，因为这些变量对可重复性至关重要），以及最低报告标准（类似于其他代谢组学领域），并建立SESI-HRMS检测化合物的数据库。这些努力将提高实验室间的可比性和可重复性，最终支持SESI在临床和监管框架中的整合。从观察到的区分特征到验证的生物标志物的路径仍然很长：早期发现之后应进行独立复制、靶向定量和生物学合理性评估——这些步骤已经为整个代谢组学领域概述，并在呼吸组学中得到重申，以帮助该领域从有前景的标志物发展到可重复的、具有临床意义的生物标志物。