《Fermentation》：Recent Advances in Natural Product Biosynthesis and Yield Improvement Strategies Using Yarrowia lipolytica
Zhaorui Gu,
Xiaojing Li,
Freddie Moore,
Anil Kumar Jamithireddy,
Steven Bates and
Nicholas J. Harmer
编辑推荐：
本综述系统阐述了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为新型工业微生物平台的最新进展。文章详细介绍了其在高价值天然产物（如萜类、类胡萝卜素、脂肪酸、有机酸等）异源合成中的潜力，并重点讨论了产量提升的核心策略，包括代谢工程、形态工程、适应性实验室进化（ALE）以及合成生物学工具（如CRISPR/Cas9、Golden Gate组装平台）的应用，为构建高效酵母细胞工厂提供了全面指导。
利用解脂耶氏酵母合成高价值化学品的潜力与策略
引言
微生物在食品、化学品和药品原料的工业生产中扮演着越来越重要的角色。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为一种非常规酵母，凭借其独特的生理和代谢特性，在工业生物技术领域崭露头角。它能够天然积累高水平脂质，并具有高产的乙酰辅酶A库，是合成萜类、类黄酮等高价值化合物的理想前体。本部分将概述其作为工业底盘细胞的关键优势，包括基因组可塑性、底物利用的广泛性以及应对复杂环境的耐受性。
解脂耶氏酵母天然产物合成进展与现有策略
1. 脂质与聚合物
作为天然产油酵母，解脂耶氏酵母是生产油脂和脂肪酸的理想底盘。其高胞内脂质浓度为多不饱和脂肪酸（PUFAs）如花生四烯酸、二十碳五烯酸（EPA）的生产提供了有利平台。通过代谢工程手段，例如过表达甘油-3-磷酸脱氢酶（GPD1）或失活线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶（GUT2），可以显著提高三酰甘油（TAG）的积累。利用乙酸等替代底物也能优化脂质生产，降低成本。
2. 糖醇
解脂耶氏酵母是生产糖醇（如赤藓糖醇、甘露醇、阿拉伯糖醇）的重要宿主。其天然合成赤藓糖醇以应对渗透压胁迫。通过基因工程（如过表达赤藓糖还原酶）和发酵工艺优化（如使用甘油为碳源并添加表面活性剂），可以大幅提高糖醇产量。例如，工程化菌株在甘油补料分批培养中，阿拉伯糖醇产量可达118.5 g/L。
3. 萜类化合物
解脂耶氏酵母通过甲羟戊酸（MVA）途径产生丰富的萜类前体，如香叶基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）和香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）。这使得它成为生产类胡萝卜素（如番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素）、单萜（如柠檬烯）和三萜（如人参皂苷）的强大平台。产量提升策略包括：优化启动子强度、过表达MVA途径限速酶、阻断竞争途径（如脂肪酸合成）、以及融合关键酶蛋白。通过综合代谢工程和发酵优化，β-胡萝卜素的产量已达到创纪录的39.5 g/L。
4. 类黄酮
解脂耶氏酵母可被工程化用于生产类黄酮化合物，如柚皮素、p-香豆酸和灯盏花乙素。其天然产生的p-香豆酸是类黄酮生物合成的关键中间体。通过采用“推-拉-阻”策略——即过表达限速酶、增强前体供应、并敲除竞争途径（如丙酮酸激酶），并优化碳氮（C/N）比，可显著提高产量。例如，（2S）-柚皮素的最高产量已达到8.65 g/L。
5. 有机酸
解脂耶氏酵母对低pH环境的高耐受性，使其成为生产有机酸（如α-酮戊二酸、琥珀酸、衣康酸、巴豆酸）的理想宿主。通过表达异源基因、优化培养条件（如使用甘油或烷烃作为底物）以及定向进化筛选突变体，可以实现有机酸的高产。例如，通过表达NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶，α-酮戊二酸的产量可提升至186 g/L。
6. 其他化合物
解脂耶氏酵母的代谢灵活性还扩展至其他高价值化学品，如烷烃、虫草素、熊果苷和紫色杆菌素。通过引入外源生物合成途径，并结合启动子优化、辅因子工程和底物利用拓展等策略，这些化合物的产量也得到了有效提升。
未来产量提升策略
1. DNA模块化组装平台的建立
基于Golden Gate组装方法的模块化DNA工具包（如YaliBricks）和CRISPR/Cas9基因组编辑工具包（如EasyCloneYALI）的开发，极大加快了解脂耶氏酵母的代谢工程迭代速度。这些工具允许快速组装和测试多基因途径，优化启动子-基因组合，实现高效的基因组整合和编辑。
2. 乙酰辅酶A和NADPH供应的优化
乙酰辅酶A是脂肪酸、萜类和类黄酮生物合成的核心前体。通过工程化丙酮酸旁路途径、增强ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）活性或利用乙酸作为底物，可以增加胞质乙酰辅酶A的供应。同时，NADPH作为关键的还原力，其供应可通过过表达依赖型脱氢酶（如苹果酸酶）或引入途径将NADH转化为NADPH来增强，从而支持高还原性产物的合成。
3. 适应性实验室进化（ALE）
ALE通过在特定选择压力下（如产物耐受性、高脂积累）对菌株进行长期传代培养，可筛选出具有优良性状的突变体。例如，通过ALE策略成功选育出耐受高浓度柠檬烯的解脂耶氏酵母菌株，将产量提高了40%以上。
4. 代谢途径的调控与设计
经典的“推-拉-阻”代谢工程策略在解脂耶氏酵母中得到广泛应用。此外，酶共定位策略（如酶融合、细胞器靶向）能提高途径通量。例如，将生物合成酶靶向脂滴或过氧化物酶体，可利用这些细胞器内富集的前体库，并减轻产物对细胞的毒性，从而显著提高类胡萝卜素或法尼烯的产量。
5. 底物的选择与优化
底物选择直接影响生产成本和产量。解脂耶氏酵母能够利用多种廉价或废弃碳源，如粗甘油、农业和工业废物流（如废弃食用油、橄榄厂废水）。通过代谢工程拓展其底物利用范围（如利用木糖、纤维素），可以实现低成本、可持续的生物制造，符合循环生物经济的理念。
6. 形态工程
解脂耶氏酵母具有典型的二型性，能在酵母态和菌丝态之间转换。这种形态转变深刻影响其分泌能力、营养摄取、生物反应器性能、细胞周期和代谢强度。研究表明，抑制菌丝形成（如敲除形态调控基因CLA4和MHY1）可以优化发酵液流变学，提高氧传递效率，并将更多碳通量导向目标产物合成，从而显著提高β-胡萝卜素等产物的产量。形态工程为解脂耶氏酵母的产量优化提供了一个新颖且极具潜力的维度。
结论与展望
本综述总结了解脂耶氏酵母作为强大细胞工厂在生产多种高价值天然产物方面的最新进展。未来，通过整合代谢工程、形态工程、ALE、合成生物学工具以及廉价底物利用等多重策略，将能进一步挖掘该酵母的生产潜力。系统性的多组学分析和计算模型将有助于识别关键调控靶点，而将形态调控与其他工程策略相结合，有望开发出在工业发酵条件下兼具高代谢活性和理想形态的稳健菌株，最终实现具有经济竞争力的商业化生产。
