HBV感染通过CENPF扩增上调CENPF表达并经由MYC通路促进肝细胞癌G1/S期转换的机制研究

《Journal of Hepatocellular Carcinoma》：CENPF Overexpression Induced by HBV Infection Facilitates the G1/S Cell Cycle Transition of Hepatocellular Carcinoma Cells via MYC Pathway

本文针对乙型肝炎病毒（HBV）感染如何导致着丝粒蛋白F（CENPF）在肝细胞癌（HCC）中过表达及其致癌机制这一未知问题，研究人员探讨了HBV感染、CENPF扩增与过表达的关系，并利用CRISPR/dCas9系统构建CENPF过表达模型，发现CENPF过表达可能通过激活MYC通路促进HCC细胞的G1/S期转换。该研究为HBV相关HCC的诊断和治疗提供了潜在新靶点。

　　

在癌症的庞大王国里，肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是令人闻之色变的“杀手”，发病率和死亡率均居高不下。而乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染，则是导致这位“杀手”登场的重要推手之一。科学家们一直在探寻HBV如何一步步将正常肝细胞推向癌变的深渊，其中，一个名为着丝粒蛋白F（Centromere Protein F, CENPF）的分子引起了注意。CENPF就像一个细胞分裂时的“指挥官”，负责染色体的正确分离。此前研究发现，它在多种肿瘤包括HCC中异常高表达，且与患者不良预后相关，甚至有望成为早期HCC的生物标志物。然而，巨大的谜团依然存在：在HBV相关的HCC中，CENPF为何会过量表达？是HBV感染导致了这一切吗？更棘手的是，CENPF蛋白分子量高达358kDa，像一尊“巨无霸”，使得直接构建其过表达模型来研究其致癌性异常困难，以往的研究多采用敲低其表达的方法。那么，CENPF的过表达究竟是HCC发生的原因还是结果？它又是通过何种具体机制推动癌症进展的呢？为了揭开这些谜题，首都医科大学附属北京友谊医院等单位的研究人员开展了一项深入研究，相关成果发表在《Journal of Hepatocellular Carcinoma》上。

为了回答上述问题，研究团队综合运用了多种技术方法。在临床样本层面，他们收集了126例HCC患者的组织（包括100例石蜡包埋组织和58例冰冻组织），通过免疫组化（IHC）、实时定量PCR（qRT-PCR）和TaqMan拷贝数检测，分析了CENPF的表达、扩增及其与HBV感染和临床病理特征的关系。在细胞模型构建上，他们使用了短发夹RNA（shRNA）敲低CENPF，并创新性地应用CRISPR/dCas9 SAM（协同激活介质）系统在HCCLM3和Huh-7细胞中构建了内源性CENPF过表达模型。在功能与机制研究中，团队通过CCK-8、划痕愈合、Transwell实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力；利用流式细胞术进行细胞周期分析；通过皮下移植瘤模型进行体内成瘤实验；并采用RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）来探寻CENPF调控的下游通路，最后使用MYC通路抑制剂10058-F4进行挽救实验验证。

研究结果

CENPF在HBV相关HCC组织中表达显著升高，且过表达与HCC细胞分化不良相关

研究人员首先在100例HCC石蜡组织和27对冰冻组织中进行检测。结果显示，与癌旁组织相比，HCC组织中CENPF的蛋白和mRNA表达水平均显著更高。更重要的是，CENPF在HBV阳性HCC组织中的表达水平显著高于HBV阴性组织。此外，CENPF在低分化HCC组织中的表达阳性率高于中高分化组织，且其表达水平与HCC患者的不良预后相关。这些结果初步将CENPF过表达与HBV感染及HCC恶性程度联系起来。

HCC中存在高频CENPF扩增且与HBV感染相关，HBx促进HCC细胞中CENPF的表达

为了探索CENPF在HBV相关HCC中过表达的机制，团队检测了58例HCC冰冻组织的_CENPF基因拷贝数。他们发现_CENPF扩增发生率为36.21%，且绝大多数扩增（90.48%）发生在HBV相关病例中，HBV阳性组织的扩增频率显著高于阴性组织。基因拷贝数与mRNA表达水平呈正相关，提示扩增可能是导致过表达的机制之一。此外，在HCC细胞中瞬时过表达HBV X蛋白（HBx）后，CENPF的mRNA和蛋白表达水平均上升，表明HBx也能直接促进CENPF的表达。

CENPF敲低和过表达的体内外模型均对HCC细胞的肿瘤生物学行为表现出抑制作用

团队构建了CENPF敲低（Huh-7, Hep3B细胞）和过表达（HCCLM3, Huh-7细胞）模型。CCK-8实验显示，两种操作均抑制了细胞的增殖能力。体内皮下成瘤实验也证实，无论是敲低还是过表达CENPF，都能抑制肿瘤的生长。对于过表达模型也抑制增殖这一看似矛盾的现象，作者推测，由于CENPF本身在G₂/M期高表达，持续的过表达可能超出了该期细胞的生理需求，导致G₂/M期转换紊乱和细胞分裂异常，从而产生毒性效应，抑制了整体增殖。

CENPF过表达促进HCC细胞从G₁期向S期转换

尽管过表达模型整体抑制增殖，但细胞周期分析揭示了更精细的调控。在CENPF敲低的细胞中，G₀/G₁期细胞比例增加，S期细胞比例减少。而在本底CENPF表达较低的HCCLM3细胞中过表达CENPF后，G₀/G₁期细胞比例显著降低，S期细胞比例显著升高。这表明，在不受G₂/M期毒性影响的背景下，CENPF能够促进细胞周期从G₁期向S期的转换。

CENPF过表达激活MYC通路从而促进G₁/S细胞周期转换

为了阐明CENPF促进G₁/S转换的分子机制，研究人员进行了RNA-seq分析。GSEA显示，在CENPF敲低的Huh-7细胞中，MYC靶点（v1和v2）等增殖相关信号通路被抑制；而在CENPF过表达的HCCLM3细胞中，MYC靶点通路被激活。qRT-PCR验证了_MYC等细胞周期相关基因的相应变化。关键的挽救实验表明，使用MYC通路抑制剂10058-F4处理CENPF过表达的HCCLM3细胞，可以逆转由CENPF过表达所促进的G₁/S期转换。这些结果强有力地证明，CENPF过表达是通过激活MYC通路来促进G₁/S期转换的。

结论与讨论

本研究首次系统地揭示了HBV感染与HCC中CENPF过表达之间的关联及其分子机制。结论表明，HBV感染可能通过两种途径导致CENPF上调：一是由HBV整合引起的基因组不稳定性导致_CENPF基因扩增；二是病毒蛋白HBx的直接转录激活作用。更重要的是，研究利用创新的CRISPR/dCas9过表达模型证明，CENPF的过表达（特别是在本底表达较低的细胞中）能够通过激活MYC信号通路，促进HCC细胞发生G₁/S期转换，从而推动肿瘤进展。这为理解CENPF在HCC，特别是HBV相关HCC发生发展中的作用提供了新的视角。

讨论部分指出，当前构建的持续高表达CENPF的模型，由于可能干扰了细胞在G₂/M期的正常功能而表现出细胞毒性，这恰恰提示CENPF的表达需要精细调控，生理性上调可能促癌，而超生理水平则可能有害。这解释了为何过表达模型整体抑制增殖，却仍能观察到其对G₁/S转换的促进作用。该研究不仅补充了人们对HBV驱动HCC进展机制的认识，将病毒整合、癌基因扩增、细胞周期调控关键蛋白和经典致癌通路（MYC）联系起来，形成了一个从病因到表型的较完整链条，而且为未来开发以CENPF为靶点的HBV相关HCC诊断和治疗策略提供了重要的理论依据。作者也指出了研究的局限性，例如当前过表达模型在模拟生理性上调方面的不足，以及需要进一步在动物模型等体系中明确HBV整合与_CENPF扩增之间的直接因果关系，为后续研究指明了方向。