《Horticulturae》：CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis in Tomato Targeting the DE-ETIOLATED1 Gene
Aurelia Scarano,
Fabio D’Orso,
Gabriella Dono,
Marcos Fernando Basso,
Barbara Felici,
Andrea Mazzucato,
Federico Martinelli and
Angelo Santino
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研究人员为探索能否通过基因编辑技术模拟自然突变体以提升番茄果实营养价值，利用CRISPR/Cas9 NHEJ技术靶向编辑番茄的SlDET1基因。研究成功获得了果实中类黄酮和类胡萝卜素含量显著提高的转基因株系，但同时也发现该基因的编辑会导致植株存活率低、生长受损且突变难以遗传。这项研究为通过精准基因编辑改良作物营养品质提供了重要见解，也揭示了SlDET1基因功能的复杂性。
你是否曾想过，我们餐桌上的番茄能否通过“基因剪刀”的精准修剪，变得不仅更加美味，而且营养价值也大幅提升？番茄作为一种全球广泛消费的蔬果，其果实中富含的类黄酮和类胡萝卜素等抗氧化物质，对人体健康具有显著的益处。在自然界中，科学家们发现了一类被称为“高色素-2”（high pigment-2, hp-2）的番茄突变体。这些突变体由于DE-ETIOLATED1（SlDET1）基因发生自然突变，其果实中抗氧化色素的含量显著高于普通番茄。SlDET1基因编码的是一种核蛋白，作为光信号通路的负调控因子，抑制植物的光形态建成。当这个“刹车”基因功能受损时，植物就像处于一个持续的“轻度应激”状态，从而大量合成具有光保护和抗氧化功能的次级代谢产物。这为通过基因工程手段改良番茄营养品质提供了绝佳的自然范本和潜在靶点。
然而，直接利用这些自然突变体进行育种存在一定局限，例如可能伴随植株矮化、产量降低等不利农艺性状。那么，能否运用现代前沿的基因编辑技术，在普通番茄品种中精准“复刻”hp-2突变体的关键遗传变异，从而创造出营养价值高且农艺性状更优的新种质呢？发表在《Horticulturae》上的这项研究，正是为了回答这个问题。研究团队利用CRISPR/Cas9系统介导的非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）修复机制，靶向了番茄SlDET1基因的第11外显子，该区域正是hp-2和hp-2j自然突变的发生位点。他们的目标很明确：在SlDET1基因的关键区域制造特定位点的突变，模拟hp-2突变体的效应，以期提高番茄果实的营养成分，同时深入评估此类编辑对植株生存、发育及突变遗传稳定性的影响。
为开展此项研究，作者运用了几个关键的技术方法。首先，他们设计了针对SlDET1基因第11外显子的两个单向导RNA（sgRNA），并构建了CRISPR/Cas9 NHEJ编辑载体。其次，他们先通过发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的毛状根转化系统，快速验证了sgRNA的编辑效率。接着，利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的稳定遗传转化技术，对番茄栽培种‘Moneymaker’和‘Micro-Tom’的外植体进行遗传转化，以期获得稳定编辑的转基因植株。在获得编辑植株后，研究人员通过Sanger测序对突变进行基因型分析，并利用高效液相色谱（HPLC）技术定量测定成熟果实中类黄酮（如芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等）和类胡萝卜素（如β-胡萝卜素、番茄红素等）的含量。同时，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术分析了类黄酮和类胡萝卜素生物合成途径中关键结构基因的表达水平。此外，还通过ABTS自由基清除实验测定了果实提取物的抗氧化能力（以Trolox当量表示）。所有实验均设置了非转基因野生型植株作为对照，并进行统计学分析。
研究结果部分，通过多个维度的数据揭示了基因编辑的效果与挑战。
3.1. SlDET1基因突变靶点的选择
研究设计的两个sgRNA（sgRNA6和sgRNA9）靶向SlDET1基因第11外显子中靠近hp-2和hp-2j自然突变位点的区域，dg、hp-2和hp-2j突变位点以及两个sgRNA在11号外显子的靶向位置。">旨在通过CRISPR/Cas9 NHEJ在该区域引入小的缺失，以破坏Det1结构域并可能影响核定位信号，从而创造出新的等位基因变异。
3.2. 毛状根转化与CRISPR/Cas9 NHEJ的sgRNA验证
通过发根农杆菌介导的毛状根转化验证了编辑载体的有效性。测序分析显示，转基因毛状根在靶位点确实产生了突变，包括两个靶点之间56 bp的精确缺失以及其他类型的缺失，证明了设计的sgRNA具有较高的编辑效率。
3.3. T0代转基因株系中SlDET1基因的靶向突变
通过稳定遗传转化，研究人员获得了少量的T0代编辑植株（#24和#96株系）。然而，编辑过程伴随着极低的芽存活率，许多再生愈伤组织呈现深色表型但无法再生为完整植株。存活下来的编辑植株（如#24）表现出矮化、叶片颜色加深等表型。基因型分析显示，#24株系在一个等位基因上存在37 bp大片段缺失（#24L），另一个等位基因有3 bp缺失（#24S），同时还存在野生型等位基因；#96株系则在一个等位基因上存在5 bp缺失。蛋白序列预测表明，这些缺失导致了SlDET1蛋白C端序列异常或截短。更重要的是，这些突变未能稳定遗传给T1代，且编辑植株普遍表现出严重的生长障碍。
3.4. SlDET1编辑的转基因株系类黄酮和类胡萝卜素含量增加
尽管存在生长缺陷，但对#24和#96株系成熟果实的生化分析显示出了积极的营养改良效果。与野生型相比，编辑株系果实中多种类黄酮含量显著升高。例如，芦丁含量几乎翻倍，柚皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和绿原酸含量也在不同编辑株系中显著增加。基因表达分析发现，类黄酮生物合成途径中的关键结构基因，如查尔酮合成酶（SlCHS）、查尔酮异构酶（SlCHI）和黄酮醇合酶（SlFLS）基因的表达在编辑株系果实中显著上调，这与类黄酮含量的增加相吻合。
在类胡萝卜素方面，编辑株系果实中的β-胡萝卜素、叶黄素和番茄红素含量也有一定程度增加，尤其是#96株系的番茄红素。与之对应，类胡萝卜素合成途径的关键基因八氢番茄红素合酶（SlPSY1）的表达也显著上调。
3.4.（续）抗氧化能力提升
抗氧化能力测定（TEAC法）进一步证实了编辑的益处。编辑株系果实亲水性和亲脂性提取物的抗氧化能力均显著高于野生型，这与果实中多酚类抗氧化物质含量的升高直接相关。
在结论与讨论部分，研究强调了本工作的双重发现。一方面，研究成功证实了通过CRISPR/Cas9 NHEJ技术靶向编辑SlDET1基因的第11外显子，能够有效模拟hp-2突变体的部分效应，即显著提高番茄果实中类黄酮和类胡萝卜素的含量，并增强其抗氧化能力。这通过上游生物合成途径关键基因（如SlCHS、SlCHI、SlFLS和SlPSY1）的上调得到了分子机制上的解释。这些发现表明，SlDET1确实是改良番茄果实营养品质（生物强化）的一个有潜力的靶点。
但另一方面，研究也揭示了这一策略面临的严峻挑战。在SlDET1基因关键区域（第11外显子）引入的突变（特别是较大的缺失）对植株具有极强的破坏性，导致极低的编辑芽存活率和再生植株的严重生长缺陷（如矮化）。仅有那些以嵌合体或杂合子形式存在、且至少保留一个野生型SlDET1等位基因的植株能够存活。更重要的是，这些编辑产生的突变无法稳定遗传给后代。这强烈暗示SlDET1基因功能的完全缺失（纯合缺失）可能是致死的，其编码的蛋白在植物正常发育和应对环境刺激中扮演着不可或缺的角色。此前报道的hp-2等自然突变体之所以能存活，是因为其突变（如点突变或导致部分mRNA正确剪接的剪接突变）属于亚致死类型，仍能保留部分蛋白功能。
因此，本研究的重要意义在于，它不仅展示了CRISPR/Cas9技术在作物营养改良中的应用潜力，更关键的是揭示了靶点选择与编辑策略的复杂性。研究结果表明，对于SlDET1这样功能关键的基因，使用容易产生不可预测indels（插入/缺失）的NHEJ修复途径进行编辑风险很高。为了实现既能增强营养品质又不严重损害植株活力的育种目标，未来可能需要采用更为精准的编辑策略，例如利用同源定向修复（HDR）途径结合供体DNA模板，在目标位点引入预先设计好的、类似hp-2的自然点突变，或者使用碱基编辑器等能够实现单碱基转换的技术。这项工作为后续通过基因编辑安全、有效地改良作物性状提供了重要的经验教训和技术路线参考。
