根据美国能源部（DoE）的指导，采用多响应优化方法对绿藻（Chlorella sp.）的收割和干燥过程进行优化，以实现最大程度的大分子回收 安德烈斯·F·巴拉哈斯-索拉诺（Andrés F. Barajas-Solano）、 安东尼奥·祖奥罗（Antonio Zuorro）、 罗伯托·拉韦基亚（Roberto Lavecchia）、 珍妮特·B·加西亚-马丁内斯（Janet B. García-Martínez）、 杰斐逊·E·孔特雷拉斯-罗佩罗（Jefferson E. Contreras-Ropero）、 内斯托尔·A·乌尔比纳-苏亚雷斯（Nestor A. Urbina-Suarez）和 德国·L·洛佩兹-巴雷拉（German L. Lopez-Barrera）

《Phycology》：DoE-Guided Multi-Response Optimization of Harvesting and Drying for Maximized Macromolecule Recovery in Chlorella sp. Andrés F. Barajas-Solano, Antonio Zuorro, Roberto Lavecchia, Janet B. García-Martínez, Jefferson E. Contreras-Ropero, Nestor A. Urbina-Suarez and German L. Lopez-Barrera

　　摘要
收获和干燥是微藻生物质加工中至关重要的后收获操作，因为它们对生物质的质量以及随后主要大分子组分的回收率有着显著影响。因此，本研究评估并优化了收获和干燥条件，以确定与叶绿体（UFPS012）中碳水化合物、蛋白质和脂质响应相关的最佳处理窗口。采用I-最优设计方法来评估干燥温度（40–60°C）、干燥时间（18–30小时）、设备（烤箱与食品级脱水机）以及收获方法（化学絮凝与电浮选）。随后，在保持电浮选和食品级脱水机不变的情况下，进一步优化了温度和时间参数。收获方法在不同响应指标中均显示出显著效果，而干燥因素则表现出依赖于代谢产物的效应。在筛选阶段，碳水化合物主要受干燥时间和收获方法的影响；蛋白质受干燥时间和设备的影响；脂质则受干燥温度、设备和收获方法的多重影响。在优化阶段，拟合的二次模型显示出了较高的拟合度（R2 = 0.9778–0.9959），优选条件为56.78°C和41.28小时。在这些条件下，模型预测总碳水化合物含量约为155.0 mg/L，总蛋白质含量约为368.4 mg/L，总脂质含量约为15.2 mg/L。过程验证表明，蛋白质的预测值与实际值之间无显著差异，而碳水化合物和脂质则存在显著差异。同时，水分含量在大约2460分钟后趋于零，这与干燥后期相符。总体而言，电浮选结合食品级脱水机定义了一种实验室规模的后收获配置方法，可用于同时调节叶绿体生物质以实现多种代谢产物的回收。未来的研究应评估特定能耗、技术经济可行性、替代干燥技术以及其他与叶绿体相关的价值化合物（如类胡萝卜素）。

1. 引言
微藻已成为生产工业重要代谢产物的关键技术平台，应用于食品系统、化妆品、制药和营养保健品领域。其价值不仅体现在不同菌株之间的生化特性多样性上，还在于通过培养策略和后收获处理能够调节生物质组成[1]。从这个角度来看，微藻生物质的增值不能仅仅取决于培养产量，因为下游操作决定了收获的生物质是否能在可重复条件下有效回收碳水化合物、蛋白质和脂质[2]。因此，进入提取或配方阶段的生物质质量受到水分去除方式以及后收获操作对细胞内化合物回收能力保持程度的强烈影响[3]。尽管在培养系统方面取得了显著进展，但在将微藻技术从实验室规模扩展到更大规模时，下游处理仍是一个主要瓶颈。这一限制源于需要在保持低固体浓度的同时，最小化物理化学劣化、污染和组成不稳定性[4]。因此，收获、脱水和干燥不应被视为辅助步骤，而应被视为直接影响工艺可行性、运营成本以及生物质后续增值适用性的操作[5,6]。尽管能源需求被广泛认为是微藻过程放大和可持续性分析中的一个重要考虑因素[7,8]，但本研究的核心挑战并非直接量化特定能源消耗，而是确定能够以技术上一致的方式保持大分子回收能力的后收获条件。在后收获操作中，收获尤为重要，因为它不仅通过回收效率影响最终生物质组成，还通过影响细胞完整性、残留无机或有机物质以及浓缩生物质对下游应用（特别是对污染物敏感的应用）的适用性来发挥作用[9]。当同一生物质用于分级、提取或配方时，这一点尤为重要，因为所选择的浓缩方法可能会在干燥前改变材料的物理化学状态。多项研究表明，基于絮凝的策略在分离性能和质量影响方面因物种、生理状态和培养基组成而异[9]。同样，pH诱导的絮凝与聚集体结构的变化、与细胞外聚合物的相互作用以及细胞壁状态和代谢特性的物种依赖性改变有关，这表明应通过与质量相关的标准而非单纯回收率来评估收获方式[10]。因此，电化学收获方法作为一种替代的生物质浓缩方法受到了越来越多的关注，因为它们可以减少直接添加絮凝剂的需求，并通过电气参数、电极配置和培养液特性来控制过程[11]。关于电浮选、电沉降和混合电化学系统的综述表明，这些方法可以实现高分离效率，但其性能仍取决于电流密度、电极材料、钝化行为和微气泡生成，所有这些因素都可能影响重复性和回收生物质的质量[12]。此外，培养状态和系统复杂性也可能进一步影响过程响应，这进一步强调了评估收获技术与人造生物质预期最终用途之间兼容性的必要性[13]。在最近的微藻生物精炼厂分析中，这种更广泛的观点越来越受到重视，其中收获被视为一种调节生物质质量和可用性的步骤，而不仅仅是一个孤立的分离步骤[14]。一旦生物质被浓缩，干燥就成为第二个决定性阶段，因为水分含量决定了储存稳定性和可提取化合物的保存情况。水相会促进酶活性、微生物生长和氧化反应，从而缩短保质期并影响目标大分子的后续回收[3]。关于藻类干燥的比较研究表明，所选技术可能会损害或保持品质属性，而干燥动力学和热质传递条件可以改变细胞基质和大分子的后续回收[15]。冷冻干燥通常与较高的保存能力相关，但由于资本和运营要求，其可扩展性会随规模增加而降低。相比之下，对流和其他热干燥方法更具可行性，但如果温度、时间和床层几何形状控制不当，可能会引起降解[6]。此外，多变量研究表明，因素间的相互作用可能主导着回收过程的响应，这意味着独立评估收获和干燥可能会得出从产品质量角度来看不完整的结论[15,16,17]。对于叶绿体生物质而言，这个问题尤为重要，因为细胞内化合物的回收不仅取决于生物质浓度，还取决于细胞膜的耐受性以及下游处理过程中施加的机械、化学和热历史[18]。最近关于普通叶绿体的研究表明，细胞壁的韧性会直接限制蛋白质和碳水化合物的释放，从而影响下游回收策略的有效性[18]。同样，关于叶绿体生物质顺序分级的最新研究表明，处理步骤的顺序和强度会显著改变整体产品回收率，这进一步强调了集成工艺设计的重要性，而不仅仅是单独比较各个操作[19]。因此，后收获流程的实际性能不能仅从收获效率或干燥速度推断出来，因为浓缩和热处理后的生物质状态共同决定了后续碳水化合物、蛋白质和脂质的回收率[2]。尽管已有部分研究探讨了收获技术、干燥行为和单独的提取方法，但在使用可用设备的实验室相关条件下，将收获方式选择与干燥策略和组成响应相结合的综合评估仍存在空白[4]。当目标不仅仅是浓缩生物质，而是获得适合后续回收多种大分子组分的后收获材料时，这一空白尤为重要。在本研究范围内，生物质质量被理解为在可比处理条件下保持碳水化合物、蛋白质和脂质组分的后收获回收能力，而不仅仅是超微结构或分子水平上的细胞损伤直接表征。为满足这一需求，本研究通过结合评估收获和干燥的方式，比较了电化学收获方法与化学絮凝方法，并应用实验设计和响应面方法来确定最大化叶绿体（UFPS012）中大分子回收率的一致操作条件。

2. 材料与方法
2.1. 藻株
叶绿体（UFPS012）来自哥伦比亚Francisco de Paula Santander大学的INValgae集合。该菌株在固化 Bold Basal 培养基（3% w/v琼脂）中培养，光照条件为80 μmol photons m?2 s?1，温度为25 ± 1°C，光照/黑暗周期为12/12小时。
2.2. 生物质生产
该菌株在500 mL玻璃瓶（GL45）中培养，含有250 mL Bold Basal 培养基，培养时间为15天。培养条件包括光照强度120 μmol photons m?2 s?1，温度25 ± 1°C，光照/黑暗周期为12/12小时。培养过程中通入过滤空气（0.6 vvm），并添加1% (v/v) CO2。15天培养期结束后，逐步扩大培养规模，直到达到20 L的工作体积。在每次扩大规模的过程中，接种物体积占总培养体积的不到20% (v/v)，当生物质浓度达到1.2 g L?1时进行转移。在最终生长阶段，藻类在30 L管式反应器（Syn-oxis algae，Le Cellier，法国）中培养。反应器通入富含1% (v/v) CO2的过滤空气（0.6 vvm），保持光照强度120 μmol photons m?2 s?1，温度25 ± 1°C，光照/黑暗周期为12/12小时，培养时间为30天。在这种操作条件下，培养物最终达到1.36 g L?1的生物质浓度，随后取出5 L样品用于收获和干燥实验。
2.3. 收获和干燥方法对生物质质量的影响
为了评估收获和干燥对叶绿体中总碳水化合物、蛋白质和脂质浓度的影响，实验采用了包含四个因素（两个数值因素和两个分类因素）的I-最优设计作为筛选阶段。该方法由Design-Expert?软件（版本22.0.2；Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA）辅助完成。研究因素及其相应范围详见表1。测试了两种不同的收获方法（电浮选和化学絮凝）以及两种干燥技术（烘箱干燥和脱水机干燥）。表1列出了收获和干燥过程中研究的主要变量（分类和数值）。在每个实验中，根据设计条件收获并干燥5 L藻类培养物。收获使用了一种低成本电浮选装置，工作体积为2 L[11,21]，配备11个铝电极（12 cm × 20 cm × 1 mm；6个阳极，5个阴极），每个电极的暴露表面积为240 cm2，总浸没接触面积为2640 cm2。电极间距为0.5 cm，操作电压为10 V，电流为5 A（50 W）。培养液在恒定搅拌（150 rpm）下处理20分钟后，收集反应器上部的浓缩生物质，并转移到不粘食品级硅胶模具中进行后续干燥[22]。这些操作条件基于先前验证的此类电浮选系统的范围，该系统在相似条件下可在20分钟内实现超过95%甚至接近100%的收获效率[11]。对于化学絮凝，将液体生物质的pH调节至11，然后加入浓缩的AlCl3溶液（16% w/v），直到最终浓度达到200 mg L?1；在pH调节和絮凝剂添加期间，悬浮液在恒定搅拌（150 rpm）下保持5分钟。20分钟无搅拌后，浓缩生物质在容器下部沉淀，通过4200 rpm（20 °C，20分钟）离心进一步浓缩。干燥前，对回收的生物质进行清洗/脱附处理，以减少残留铝含量，从而减少其对代谢产物定量的潜在干扰，遵循电浮选藻类生物质的处理策略[23]。生物质干燥在50 L实验室级烤箱（BINDER，Tuttlingen，德国）中进行，而脱水实验使用本地生产的120 L食品级脱水机（110 V）。所有由实验设计定义的收获和干燥处理都进行了三次重复实验。2.4. 工艺优化：总碳水化合物、蛋白质和脂质回收率的工艺变量优化是通过中心复合设计（CCD）进行的。在筛选阶段之后，应用CCD来优化干燥温度和干燥时间，而前一阶段选定的收获和干燥方法保持不变。根据拟合模型得到的优度标准确定最佳工艺条件。使用GraphPad Prism?软件（版本10.6.1；GraphPad Software, Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）通过双尾单样本t检验来确认优化结果。为此，最佳条件的实验验证包括原始运行和五次额外的重复实验，并将在这些优化条件下获得的值与模型预测的值进行比较。统计显著性在α = 0.05的水平上进行评估。2.5. 代谢物定量：代谢物浓度是根据使用方法特异性参考标准准备的校准曲线确定的。D-葡萄糖、牛血清白蛋白（BSA）和菜籽油分别用作总碳水化合物、蛋白质和脂质的校准标准，每个代谢物的浓度是根据相应的校准方程（方程（1）–（3）计算得出的。2.5.1. 总碳水化合物：总碳水化合物的测定方法参考了Moheimani等人的研究[24]。将5毫克的干燥生物量转移到15毫升的试管中，与5毫升的1 M H2SO4混合，并在1500转/分钟的速度下涡旋10分钟。混合物在100°C下孵育60分钟，冷却至室温，然后在2876× g的离心力下离心20分钟。随后，将2毫升的上清液与1毫升的酚溶液（5% w/v）和5毫升的浓H2SO4混合；冷却后，在485纳米处测量吸光度。根据重复标准（0到10毫克/升）构建了一个葡萄糖校准曲线，并基于实验观察到的线性范围确定最终回归线。为了避免斜率估计和样品量化的偏差，将该区间外的低浓度点排除在最终拟合之外（R2 = 0.9999）。总碳水化合物的浓度使用方程（1）确定。2.5.2. 总蛋白质：总蛋白质的测定方法参考了Slocombe等人的研究[25]。将20毫克的干燥生物量（相当于40毫克的新鲜生物量）与0.8毫升的24%（w/v）三氯醋酸（TCA）在耐酸试管中混合。样品在95°C的水浴中加热15分钟。之后，加入2.4毫升的超纯水，然后将混合物离心（5000转/分钟，20分钟，4°C）。所得沉淀物重新悬浮在0.5毫升的Lowry D试剂中，并在55°C的水浴中加热60分钟。试管再次离心（5000转/分钟，15分钟，4°C）。随后，将0.15毫升的上清液与2.85毫升的Lowry D溶液混合。样品在室温（25 ± 1°C）下孵育10分钟。接下来，样品与0.3毫升的Folin–Ciocalteu试剂混合，并在室温（25 ± 1°C）下孵育30分钟。然后，在600纳米处测量样品。根据重复标准（0到35毫克/升）构建了一个BSA校准曲线，并基于实验观察到的线性范围确定最终回归线。为了避免斜率估计和样品量化的偏差，将该区间外的低浓度点排除在最终拟合之外（R2 = 0.9992）。总蛋白质的浓度使用方程（2）确定。2.5.3. 总脂质：总脂质的定量使用Mishra等人的方法[26]进行。将5毫克的干燥生物量与2毫升的浓H2SO4混合，并在1500转/分钟的速度下涡旋5分钟。混合物在100°C下孵育10分钟，然后在冰浴中冷却5分钟。接下来，将5毫升的新鲜磷酯香草素与2毫升的浓H2SO4混合，并在1500转/分钟的速度下涡旋5分钟。混合物在100°C下孵育10分钟，然后在冰浴中冷却5分钟。之后，加入5毫升的新鲜磷酯香草素试剂，并在37°C下孵育15分钟。混合物在2876× g的离心力下离心20分钟，然后在上清液的530纳米处测量吸光度。总脂质浓度以毫克/升（方程（3）表示，使用根据Mishra等人[26]调整后的磷酯香草素校准方程（R2 = 0.9942）计算得出。2.6. 水分含量和干燥速率：从干燥设备中取出收获的生物量样本，以确定该过程的最佳水分比和干燥速率。藻类生物量在时间t的水分含量Xt（克水/克干物质）可以根据方程（4）定义。水分含量可以根据方程（5）表示为无量纲水分比MR：水分含量可以表示为MR = Xt - Xe，其中Xi和Xe分别是初始水分含量和平衡水分含量。在较长的干燥时间下，Xe可以忽略不计与Xi相比；因此，方程（5）可以简化为方程（6）：藻类生物体的干燥速率（DR）可以根据方程（7）从水分含量计算得出：DR = Xt + Δt - XtΔt，其中DR是干燥速率（克水/克干物质/分钟），Xt+Δt是时间t的水分含量，Δt是时间增量（分钟）。3. 结果：3.1. 收获和干燥方法对生物量质量的影响：使用I-最佳设计作为筛选阶段，评估收获和干燥条件对收获后生物量中总碳水化合物、蛋白质和脂质回收率的影响。相应的ANOVA结果和模型统计信息总结在表2中，而实验矩阵、每次运行的观察结果及相应的平均值提供在补充表S1中。ANOVA确认拟合模型对这三个响应都是统计显著的。对于总碳水化合物，干燥时间（B）和收获方法（D）是显著因素，而干燥温度（A）和干燥设备（C）在评估范围内不显著。对于总蛋白质，干燥时间（B）、干燥设备（C）和收获方法（D）显著影响了响应，而干燥温度（A）不显著。对于总脂质，干燥温度（A）、干燥设备（C）和收获方法（D）显著，而在评估条件下干燥时间（B）没有显著效果。表2. 从I-最佳设计中获得的结果的ANOVA，用于选择最相关的变量。拟合模型对三个响应的拟合优度良好，R2值分别为总碳水化合物0.9701、蛋白质0.8470和脂质0.9796。同样，调整后的R2值分别为碳水化合物0.9401、蛋白质0.7814和脂质0.9593，而预测的R2值分别为0.8451、0.6083和0.8787。在所有三种情况下，调整后的R2与预测的R2之间的差异均小于0.2。此外，总碳水化合物、总蛋白质或总脂质的拟合不足检验不显著。根据响应表面图，电浮选与化学絮凝相比，与更高的碳水化合物、蛋白质和脂质回收率相关。同样，与对流干燥烤箱相比，脱水器在评估的干燥条件的高端范围内显示出更高的响应。3.2. 代谢物提取的干燥时间和温度优化：在筛选阶段之后，应用了包括14次运行的中心复合设计（CCD），分为两个组，以优化在之前选择的电浮选和脱水器干燥条件下的干燥温度和干燥时间。相应的ANOVA结果和模型统计信息总结在表3中，而实验矩阵、每次运行的观察结果及相应的平均值提供在补充表S2中。对于总碳水化合物、蛋白质和脂质，ANOVA结构中保留了组项，相关的平方和在表3中呈现。ANOVA确认拟合的二次模型对这三个响应都是统计显著的。对于总碳水化合物，干燥温度（A）、干燥时间（B）、交互项（AB）和二次项A2显著，而B2不显著。对于总蛋白质，干燥温度（A）、干燥时间（B）、交互项（AB）和两个二次项（A2和B2）显著影响了响应。对于总脂质，干燥时间（B）、交互项（AB）和两个二次项（A2和B2）显著，而在评估范围内干燥温度（A）没有显著效果。表3. 从中心复合设计获得的结果的ANOVA。拟合的CCD模型对三个响应的拟合优度良好，R2值分别为总碳水化合物0.9778、蛋白质0.9933和脂质0.9959。同样，调整后的R2值分别为碳水化合物0.9620、蛋白质0.9885和脂质0.9930，而预测的R2值分别为0.9159、0.9840和0.9905。在所有三种情况下，调整后的R2与预测的R2之间的差异均小于0.2。此外，总碳水化合物、总蛋白质或总脂质的拟合不足检验不显著。这些结果表明二次模型在评估的实验范围内充分描述了三个响应的行为。根据Design-Expert?生成的最终模型输出，得到了三个响应的实际因素的拟合二次方程。这些方程描述了在评估范围内总碳水化合物、蛋白质和脂质作为干燥温度和干燥时间的函数的预测行为。相应的预测模型如下所示：方程（8）–（10）。图1展示了从中心复合设计得到的总碳水化合物（a）、总蛋白质（b）、总脂质（c）和整体优度函数（d）的响应表面。对于总碳水化合物（图1a），表面显示在评估范围内预测响应逐渐增加，最高值位于较长的干燥时间和模型的较高温度范围。同样，对于总蛋白质（图1b），在较长的干燥时间观察到更高的预测值；然而，在这种情况下，最大响应区域移动到了比碳水化合物更低的温度值。因此，在研究的区间内，碳水化合物响应从设计空间的较低区域（接近40°C和12小时）增加到大约39–48小时的干燥时间和超过60°C的温度，而蛋白质响应在大约39–48小时和大约40–50°C达到最高值，然后随着温度增加到68–75°C而逐渐减少。图1. 从中心复合设计得到的总碳水化合物（a）、总蛋白质（b）、总脂质（c）和模型优度（d）的响应表面。相比之下，总脂质的响应表面（图1c）显示了一个内部最大值，而不是在整个范围内单调增加。具体来说，最高的预测脂质值集中在大约30–39小时和大约54–61°C，中心最大值在35小时和60°C附近，而响应在较低和较高的干燥时间和温度值时减少。此外，理想性表面（图1d）将三种拟合响应整合在相同的实验范围内，在中等至较高温度结合较长干燥时间的情况下显示出最高的预测值，特别是在54–61°C和大约30–45小时之间；相反，在设计空间的边缘观察到较低的理想性值，尤其是在对应于低干燥时间和评估温度区间极值的组合中。3.3 工艺验证使用理想性函数进行数值优化，以确定同时最大化三种拟合响应的干燥条件。理想性表面显示最佳条件为56.78°C和41.28小时，这对应于评估范围内的最大预测理想性值。从CCD模型获得的这些优化条件随后被应用于新鲜收获的生物质进行干燥，使用双尾单样本t检验比较了总碳水化合物、总蛋白质和总脂质的预期和观察浓度。图2显示了在优化干燥条件下的预期和观察值。对于总碳水化合物（图2a），观察到的浓度与预测值有显著差异（p < 0.0001）。相比之下，对于总蛋白质（图2b），预期和观察值之间没有显著差异（ns）。对于总脂质（图2c），观察到的浓度也与预测值有显著差异（p = 0.0150）。图2. 在优化干燥条件下，总碳水化合物（a）、总蛋白质（b）和总脂质（c）的预期与观察浓度。3.4 收获生物质的含水量和干燥速率图3a,b显示了在优化收获和干燥条件下收获生物质的含水量比和干燥速率曲线。在这方面，含水量比在过程初期显著下降，从1.0降至早期干燥阶段的接近零的值；随后，在后续时间段内保持接近零，在大约2460分钟（41小时）时已经接近零。同样，干燥速率曲线在初始测量区间显示出最大值，然后在整个过程中持续下降。此外，在早期阶段观察到最大的变化，而在后期时间曲线呈现逐渐降低的斜率，并在最终干燥阶段达到较低的值。此外，图3c显示了在优化条件下获得的干燥藻类生物质片。图3. 在最佳收获和干燥条件下，藻类生物质的含水量比（a）和干燥速率（b）。干燥的藻类生物质片（c）。4. 讨论 4.1 收获路线作为收获后生物质条件的影响因素在整个筛选阶段中，收获是唯一显著影响三种代谢物响应的因素，这表明生物质的收获后状态受到干燥前分离路线的强烈影响。收获不仅作为一个浓缩步骤，似乎还通过改变回收固体的物理和化学状态来调节碳水化合物、蛋白质和脂质的后续回收行为。在这方面，三种代谢物观察到的不同重要性模式表明，响应不仅取决于生物质保留，还取决于传递到干燥阶段的材料的特性。这一解释与先前的研究一致，这些研究表明收获配置可以改变与生物质相关的无机部分、聚集紧凑性以及下游处理过程中细胞内或结构结合部分的实际可访问性[10,13]。关于微藻收获的最新综述进一步强调，基于絮凝和电化学的路线在生物质质量方面的效果不一定相等，即使生物质来自相同的培养批次[28]。在这一框架内，与化学絮凝相比，电浮选相关的更高响应可以归因于回收后生物质状态的差异，而不仅仅是分离效率的简单对比。在化学絮凝过程中，添加铝基混凝剂可能会增加与收获生物质相关的矿物质部分或改变带入下游处理的离子环境[29]。当从相同的收获后基质中评估多个部分时，这一方面尤为重要，因为残留的盐或金属可能会影响材料的下游行为和分析响应。相比之下，电化学收获减少了对外加混凝剂的直接需求，尽管其性能仍依赖于电参数、电极材料和介质化学性质[30,31]。最近的研究表明，当使用铝电极时，残留的铝可能会与回收的生物质相关联，并可能需要一个选择性的后洗涤步骤来最小化带入后续分析的残留物[23]。此外，最近的电化学收获研究在优化操作条件下报告了超过95%的回收效率，这加强了收获设计作为下游生物质条件决定因素的重要性[31]。在本研究的范围内，这些先例为解释为什么收获路线在三种代谢物响应中仍然显著提供了统一的依据，以及为什么其在碳水化合物、蛋白质和脂质之间的效果不一致提供了依据。4.2 干燥强度和碳水化合物、蛋白质及脂质组分的差异行为筛选阶段、CCD和响应曲面的综合结果表明，干燥强度对三种代谢物组分的影响方式不同。对于碳水化合物，响应向更长的干燥时间和评估范围内的较高温度区域偏移，将这一组分置于实验空间中热和时间强度更大的区域。实际上，这种模式表明，在与更大水分去除相关的条件下，碳水化合物的回收更为有利，而不是由单一变量独立作用。关于微藻干燥动力学的先前研究表明，较长的干燥时间直接反映在较低的水分残留量和随后分析回收过程中固体相关组分的可访问性变化上，特别是在以渐进性水分损失为主的对流制度下处理生物质时[13,32]。最近对小球藻干燥行为的分析也支持水分去除的演变强烈依赖于所施用的热制度，并且固体的行为在干燥轨迹中显著变化，即使在相对狭窄的温度区间内也是如此[33]。在本研究的范围内，这些先例为解释为什么碳水化合物的最大值向更长的干燥时间和更高的温度偏移提供了统一的依据，而无需具体说明特定结构机制。蛋白质和脂质观察到了不同的分布，表明这些组分的最佳区域与碳水化合物的最佳区域不一致。对于蛋白质，在较长的干燥时间和中等至较低的温度下观察到最高响应，将富含蛋白质的区域置于比与碳水化合物最大值相关的区域更不严格的因子空间部分。这种分离与广泛描述的小球藻蛋白质在收获后处理过程中的热敏感性相符，尤其是在温度成为比水分去除更强的决定因素时[34,35,36]。最近关于微藻干燥的综述还指出，随着干燥强度的增加，热处理更容易损害蛋白质质量，尽管效应的程度取决于生物质组成和干燥配置[3]。对于脂质，响应曲面在评估范围内没有显示出单调增加；相反，最高值集中在中间温度和干燥时间的内部区域，这表明操作窗口比碳水化合物或蛋白质观察到的要窄。在干燥研究中也报告了类似的内部最大值，其中与脂质相关的响应不在最高温度或时间水平上受到青睐，而是在平衡脱水和热暴露的中间条件下[32,36]。总的来说，这些模式表明干燥作为一个调节阶段，每个组分的响应被置于因子空间的不同区域。4.3 多变量模型的二次行为、交互效应和折中区域中心复合设计通过揭示三种代谢物的干燥温度和干燥时间之间的非线性响应和显著交互效应，细化了筛选阶段中确定的趋势。对于碳水化合物，干燥时间的优势以及交互项的重要性和温度的二次贡献表明，响应在评估范围内不是线性增加的，而是向一个区域偏移，在该区域中，长时间干燥的效果取决于施加的温度水平[32]。对于蛋白质，温度、时间、交互作用和两个二次项的同时重要性表明，对干燥温度和干燥时间的组合变化的响应更加明显，反映在比碳水化合物观察到的响应区域更窄的区域[34,35,36]。对于脂质，两个二次项和交互项的相关性以及线性温度项的不显著性将脂质响应置于一个明显非单调的区域内，其中响应集中在一个内部最优值附近，而不是在实验空间的极端值[32,36]。在这个意义上，CCD不仅仅确认了筛选趋势，还捕捉了在选定的处理窗口内观察到的三种代谢物响应的曲率和交互模式。尽管在中心复合设计的ANOVA结构中保留了块项，但其贡献相对于三种响应的拟合模型项来说较小。在表3中，与块项相关的平方和分别为碳水化合物0.0223、蛋白质23.95和脂质1.12，而相应的模型平方和分别为389.26、1.019 × 105和221.29。这种对比表明，通过分组捕获的变异性与干燥温度、干燥时间和它们交互作用的系统效应相比较小。实际上，保留块项保持了CCD的实验结构，而没有改变整体解释，即响应曲率和折中区域的形成主要由过程变量而不是块间变异性控制。这一解释进一步得到了为三种响应获得的拟合预测方程（方程（8）–（10）的支持。在这三个模型中，负的二次系数表明在评估范围内存在向下曲率，这与有界响应表面相符，而不是不受限制的线性增加。对于总碳水化合物，正的交互系数以及负的二次项表明，干燥温度和干燥时间的组合增加有利于在研究区域内的响应，尽管当这两个因素偏离中心区域时，这种趋势逐渐受到限制。对于总蛋白质，两个因素的正线性系数结合负的二次项描述了一个最初随温度和时间增加的响应，但在两个因素的水平较高时逐渐受到限制。相比之下，脂质方程显示两个因素的负二次系数以及负的交互项，这与响应表面确定的内部最优值以及在中等干燥条件下预测值最高的浓度一致[32,36]。在响应表面研究中也报告了类似的行为，其中二次模型定义了有界的最优值，二阶项的符号与实验空间内的边缘或内部静止区域的位置直接相关[23,37]。这种响应的差异曲率也反映在响应表面和理想性函数中。最高预测的碳水化合物和蛋白质回收区域分别位于因子空间的不同部分，而脂质响应则集中在中等干燥条件下的内部最大值附近。因此，整体理想性最大值并不与任何单一代谢物的个别最优值重合，而是与位于56.78°C和41.28小时的折中区域重合，在该区域三种拟合响应在评估范围内达到了最高的同步一致性。由于理想性函数同时整合了三种响应的拟合行为，因此最终的折中点并不限于筛选阶段最初确定的区域，而是位于CCD区域，那里获得了碳水化合物、蛋白质和脂质响应之间最好的联合一致性。在这个意义上，最优值位于56.78°C和41.28小时，这反映了二次模型引入的优化以及CCD阶段解析的交互作用结构，而不是任何单一因素的孤立效应。在多变量优化中使用期望函数时，个体最优值和全局最优值之间的这种类型的偏移被广泛报道，最终解决方案对应于部分发散响应表面的最佳联合满足，而不是单个变量的孤立最大化[32]。在本研究的范围内，该区域的位置表明，收获后的优化空间是由代谢物特定的响应窗口以及干燥阶段内时间和温度的交互作用所塑造的，而不是由单一因素对三个组分进行均匀作用所形成的。

4.4. 预测一致性、过程范围和研究局限性
在优化条件下的验证为评估拟合模型的预测一致性提供了有用的基础。在预期值与观测值的比较中，蛋白质回收率没有显示出显著差异，而碳水化合物和脂质则表现出了差异，这表明模型预测与实验验证之间的一致性在三种响应上并不等同[16,32]。同时，水分比和干燥速率曲线表明优化条件位于干燥轨迹的最后阶段，因为生物质在大约2460分钟（41小时）时接近零水分比，而干燥速率曲线在初始阶段达到最大值，然后逐渐下降[32,38]。在这些条件下，优化点可以解释为三个拟合响应共同行为的结果，而不是单一代谢物的个别最大值[16,32]。

同时，目前的研究结果应在直接测量的变量的限制范围内进行解释。该研究展示了碳水化合物、蛋白质和脂质回收率随收获方式和干燥条件的不同而变化；然而，它并没有提供关于水分状态、孔隙度、聚集体紧凑性、细胞壁破坏、残留矿物质负荷、脂质氧化或蛋白质变性的直接证据。在微藻的下游加工中，这些描述符通常用于加强干燥和脱水响应的解释，特别是在讨论组成和结构效应时[6]。因此，这里提出的解释得到了先前文献的一致性支持，而不是基于对加工后生物质的直接结构或物理化学特性的分析。这一考虑对于脂质响应尤为重要，因为其绝对值取决于磺基-膦基-香草醛测定的分析基础，以及在不同收获方式之间的比较，其中残留无机物的贡献没有独立量化[29]。

此外，本工作中确定的优化条件更应被视为一个实验室规模的加工区域，用于从相同的收获后生物质中同时回收三种代谢物组分。最近的综述表明，干燥和脱水仍然是微藻工艺链中能源密集度和规模敏感性最高的阶段之一，这意味着实验室最优值的相关性最终必须结合特定能源需求、设备配置和技术经济性能来考虑[6,39]。在这方面，对替代干燥技术、残留矿物质组分以及干燥后生物质的结构属性的进一步评估将有助于更全面地解释本研究中识别的代谢物特定响应窗口。

5. 结论
收获和干燥被确认为决定性地影响从小球藻（Chlorella sp. (UFPS012) 中回收碳水化合物、蛋白质和脂质组分的关键步骤。筛选阶段显示，收获方法是唯一在三种响应中都显著的因素，这表明浓缩后的生物质处理对下游性能起着决定性作用。相比之下，干燥因素表现出依赖于代谢物的效应：碳水化合物主要受干燥时间和收获方法的影响，蛋白质受干燥时间、设备和收获方法的影响，脂质受干燥温度、设备和收获方法的影响。在评估的范围内，电浮选结合食品级脱水器提供了最有利于多种代谢物回收的生物质同步处理的收获后配置。

通过中心复合设计和响应面方法进行的优化确定了在56.78°C和41.28小时的折中条件，在该条件下，拟合模型的拟合优度很高（R2 = 0.9778–0.9959）。在这些条件下，预测的响应值分别为总碳水化合物155.0 mg/L、总蛋白质368.4 mg/L和总脂质15.2 mg/L。实验验证显示，蛋白质的预测值与观测值之间没有显著差异，而碳水化合物和脂质则存在显著差异，表明预测一致性依赖于响应类型。同时，水分比在大约2460分钟时接近零，而干燥速率在整个过程中逐渐下降，表明所选条件处于干燥过程的后期阶段。总体而言，本研究定义了一个适用于小球藻生物质的实验室规模收获后处理区域，并为未来研究特定能源需求、技术经济可行性、替代干燥技术、残留矿物质组分以及其他与小球藻相关的高价值化合物（如类胡萝卜素）的回收提供了依据。

补充材料
以下支持信息可在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/phycology6020035/s1