《Green Chemistry Letters and Reviews》：Unique and earth-friendly RP-HPLC approach for quantification and degradation of metoprolol and enalapril maleate: a new approach to combination therapy
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摘要：美托洛尔（MET）与依那普利（ENA）的协同作用可增强血压控制并降低心血管风险。探究二者在同一制剂中联合给药至关重要。本研究旨在建立一种基于反相高效液相色谱（RP-HPLC）的可持续替代方法，以替代有毒化学品并减少废物产生，用于检测原料药及药物制剂中ME
摘要：美托洛尔（MET）与依那普利（ENA）的协同作用可增强血压控制并降低心血管风险。探究二者在同一制剂中联合给药至关重要。本研究旨在建立一种基于反相高效液相色谱（RP-HPLC）的可持续替代方法，以替代有毒化学品并减少废物产生，用于检测原料药及药物制剂中MET与ENA的含量。RP-HPLC采用等度洗脱模式，使用InertSustain C8柱（250×4.6 mm，5 μm），样品温度设为5°C，柱温箱设为40°C，流动相为pH 2.5磷酸钾缓冲液与乙醇按50:50（v/v）混合。该方法运行时间为7分钟，进样体积20 μL，流速1.0 mL/min。MET与ENA在3–60 μg/mL浓度范围内呈良好线性，相关系数R2≥0.999。ENA的检测限（LOD）为0.29 μg/mL，定量限（LOQ）为0.90 μg/mL；MET的LOD为0.33 μg/mL，LOQ为0.98 μg/mL。方法准确度良好，加标回收率研究显示为98–102%。研究人员按国际协调会议（ICH）准则验证了方法的稳定性。即便存在降解产物，该方法仍能准确检测和定量MET与ENA，获得了更优的定性与定量结果。
论文解读：基于绿色反相高效液相色谱（RP-HPLC）的美托洛尔与马来酸依那普利同步定量及稳定性指示降解分析
研究背景与意义
美托洛尔（Metoprolol, MET）为选择性β1-肾上腺素受体阻断剂，依那普利（Enalapril, ENA）为血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂，二者联用可作用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）与交感神经系统的不同环节，增强降压效果并改善心力衰竭患者预后。然而，现有分析文献多集中于单组分紫外分光光度法或单组分高效液相色谱（HPLC）测定，缺乏能同时定量MET与ENA并具有稳定性指示（Stability-Indicating）能力的反相高效液相色谱（RP-HPLC, Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography）方法；此外，传统HPLC常使用乙腈或甲醇等高毒有机溶剂，不符合绿色分析化学（GAC, Green Analytical Chemistry）原则。该研究发表于《Green Chemistry Letters and Reviews》，研究人员针对以上缺口，开发并验证了一种以乙醇替代高毒溶剂、短运行时间的绿色RP-HPLC方法，可同时测定MET与马来酸依那普利（Enalapril Maleate），并通过强制降解（Forced Degradation）实验证明其为主成分与降解产物分离的稳定性指示方法，为潜在固定复方制剂的质量控制提供依据。
主要关键技术方法
研究人员以美托洛尔琥珀酸盐（纯度98.97%，浙江海索）与依那普利马来酸盐（纯度99.68%，长沙阿什琳）为对照品，市售单药片（MET 50 mg，Selokenzoc；ENA 20 mg，ENALAP）为供试制剂。采用Agilent 1200系列HPLC配二极管阵列检测器（PDA, Photodiode Array Detector）及InertSustain C8柱（250×4.6 mm，5 μm），经等度洗脱条件优化确定最佳流动相为pH 2.5 1 mM磷酸二氢钾缓冲液—乙醇（50:50, v/v），流速1.0 mL/min，柱温40°C、样品室5°C，检测波长215 nm，进样量20 μL，运行7 min。按ICH Q2(R1)指南进行专属性、线性（3–60 μg/mL）、准确度（加标回收50%、100%、150%）、精密度（日内/日间）、检测限（LOD）/定量限（LOQ）、稳健性及系统适用性验证；开展酸（0.1 N HCl，70°C，3 h，中和）、碱（0.1 N NaOH，同条件，中和）、氧化（30% H2O2，暗处24 h）、光解（自然日光1 h）、热（70°C固体，2 h）五种强制降解试验；并以AGREE、Analytical Eco-Scale（ESA）、GAPI、AGREEprep、BAGI、AMGS、HPLC-EAT及AMVI等多工具评估方法绿色度。
研究结果
Introduction（引言）
研究人员综述了MET与ENA药理互补机制及临床联用合理性，指出现存文献缺乏对二者同时测定的RP-HPLC方法及绿色溶剂替代方案，提出开发环境友好型稳定性指示RP-HPLC的必要性。
Experimental（实验部分）
详述对照品与市售片剂来源、仪器配置（Agilent 1200系列，PDA检测器，C8柱）、流动相[1 mM KH2PO4水溶液调pH 2.5 with H3PO4与乙醇50:50(v/v)]与稀释液（双蒸水）配制、储备液（500 μg/mL）与工作液（20 μg/mL）制备、市售制剂提取制样流程，以及按ICH指南执行的校准曲线构建（3–60 μg/mL，六点三重复）、方法验证项目（专属性、线性、准确度、精密度、LOD/LOQ、稳健性）与强制降解各条件操作细节（酸/碱水解后中和至pH 7，氧化、光解、热处理）。
Methods development and optimization（方法开发与优化）
研究人员经筛选多种柱型（C8、苯基、氰基）、缓冲液pH（最终选pH 2.5磷酸盐）、有机相（最终选乙醇替代甲醇/乙腈）及柱温（40°C）、样品温度（5°C）、波长（215 nm），确定最优色谱条件使MET与ENA获得对称尖锐峰且互不干扰，保留时间分别约3.075 min与5.115 min，总运行7 min。
Method validation（方法验证）
按ICH Q2(R1)验证显示：专属性良好，空白与辅料不干扰主峰，各强制降解条件下主药峰纯度指数＞990；MET与ENA在3–60 μg/mL内线性良好（R2≥0.999）；加标回收率为98%–102%；日内/日间相对标准偏差（RSD）＜2%；MET的LOD为0.33 μg/mL、LOQ为0.98 μg/mL，ENA的LOD为0.29 μg/mL、LOQ为0.90 μg/mL； deliberate变动波长（±2 nm）、乙醇比例（±1%）、流速（±0.1 mL/min）时系统适用性参数仍合格，方法具稳健性。
Forced degradation studies（强制降解研究）
酸水解：ENA出现依那普利拉（Enalaprilat，乙酯水解产物）额外峰，MET出现微量α-羟基美托洛尔相关杂质峰。碱水解：ENA明显生成依那普利拉峰并与主峰基线分离，MET出现微量水解产物。氧化降解（H2O2）：二者均出现新峰，ENA倾向形成二酮哌嗪类氧化产物，MET倾向形成美托洛尔N-氧化物。光解：ENA轻微降解生成二酮哌嗪类产物，MET基本光稳定仅见痕量芳环羟基化产物。热降解（70°C，固体，2 h）：两药均较稳定，未见明显新降解峰。所有条件下主药与降解产物分离度＞2，峰纯度合格，证实方法具稳定性指示能力。
Assessing the sustainability of the techniques meticulously（绿色度评估）
多工具量化评估结果为：AGREE＝0.70（≥0.70为优秀），Eco-Scale＝78（＞75为高度绿色），AGREEprep＝0.72，BAGI＝82.5/100，AMGS＝153.37，HPLC-EAT＝1.308（低环境影响），AMVI较低；GAPI与ComplexGAPI主要区域为绿色，证实乙醇基短时长方法符合GAC原则。
Proposed degradation mechanisms of MET and ENA（推测降解机制）
研究人员依保留时间及文献归纳：ENA在酸/碱下发生乙酯水解生成依那普利拉，氧化/光解倾向闭环为二酮哌嗪衍生物，热条件下降解极少；MET在酸/碱下芳环发生羟基化为α-羟基美托洛尔，氧化生成美托洛尔N-氧化物，光/热条件下基本稳定，仅光解可见微量芳环羟基化。
Drug dosage form assay（市售制剂含量测定）
以该法测定市售MET 50 mg片与ENA 20 mg片，平均测得量回收率分别为100.56%（MET）与99.61%（ENA），与标准品对照吻合，表明方法适用于实际制剂质控。
讨论与结论翻译
讨论指出本RP-HPLC法相较既往单组分方法具如下优势：可同时测定MET与ENA且峰形清晰；具稳定性指示特性（尤碱水解条件下选择性识别依那普利拉）；采用乙醇替代高毒溶剂且运行时间短（7 min），降低环境与操作风险；适合制药质量控制（QC）高通量应用。局限在于降解产物结构归属仅为基于保留时间与文献的初步推断，未来拟结合液相色谱-质谱（LC-MS/MS）或核磁共振（NMR）确证及开展长期稳定性研究。
Conclusion（结论）
研究人员成功建立并验证了一种创新、具稳定性指示及环境友好的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法，可同时定量美托洛尔与马来酸依那普利。该方法符合ICH Q2(R1)要求，专属性、线性、准确度、精密度及稳健性良好，能有效分离主药与其强制降解产物。以乙醇替代有毒有机溶剂且运行时间仅7分钟，经八项绿色评估工具（AMVI、ESA、AGREE、AGREEprep、GAPI、ComplexGAPI、BAGI及HPLC-EAT）证实其生态效益。鉴于MET与ENA临床联用的循证基础，该方法填补了分析文献空白，为未来固定剂量复方制剂的开发、质量控制及稳定性试验提供实用、可持续且可靠的解决方案。
