基于F统计量的多维缩放：利用推断方法可视化分组后的微生物组数据

《PLOS Computational Biology》：Multidimensional scaling informed by F-statistic: Visualizing grouped microbiome data with inference

　　摘要
多维缩放（MDS）是一种广泛用于微生物生态数据分析中的降维技术，它能够在保留样本间成对距离的同时捕捉数据的多变量结构。尽管MDS的改进增强了揭示群体特定数据模式的能力，但这些基于MDS的方法需要先验假设来进行推断，这限制了其在一般微生物组分析中的应用。在这项研究中，我们介绍了一种新的基于MDS的排序方法——“F信息MDS”，该方法根据F统计量（共享相同和不同特征的群体之间的分散度比率）来配置数据分布。使用半合成数据集，我们证明了所提出的方法对超参数选择具有鲁棒性，并在整个排序过程中保持了统计显著性。各种用于评估降维的质量指标证实，F信息MDS在保持局部和全局数据结构方面与最先进的方法相当。将其应用于与硅藻相关的细菌群落，表明了这种新方法在解释群落对宿主响应中的作用。我们的方法为MDS提供了合理的改进，使其与统计测试结果一致，这对于微生物学和生态学中的更广泛的多维数据分析非常有益。这种新的可视化工具可以整合到标准的微生物组数据分析中。

作者总结
多维缩放（MDS），也称为主坐标分析，是通过高通量测序处理的微生物群落样本进行探索性数据分析的基本步骤。MDS结果的解释通常涉及将MDS获得的模式与施加在样本上的实验处理（如环境条件或宿主表型）联系起来。然而，在排序过程中保留这些模式并不总是有保证的，因为MDS本身在其学习过程中不考虑群体信息。这一限制降低了传统MDS的有效性，特别是在需要保持有意义的生物模式的通用微生物组数据集中。为了解决这一差距，我们提出了一个鲁棒的统计框架，旨在以较低的维度表示微生物组数据，同时保留原始维度中群体差异的假设检验结果。我们的方法依赖于F统计量测量的样本分散度，确保了比现有排序方法更稳定和可靠的性能。通过将统计严谨性纳入排序过程，我们的框架改进了微生物群落数据的可视化，并允许在合理范围内调整配置。这一进步为研究人员提供了分析和解释复杂微生物组数据的更有效工具，最终得出有洞察力的结论。

引言
基因测序技术和多变量数据分析的发展促进了我们对微生物多样性的理解，这两种技术试图通过针对这一系统发育中的保守基因区域（16S rRNA基因）或分析所有存在的基因（即全宏基因组测序）来解释微生物群落的组成。从这些测序工具获得的生态结构与其他生物数据类型不同，因为它们是组合性的[1,2]、稀疏的[3]，并且其特征在系统发育树下相关联，提供了额外的基因组背景[4,5]。在预处理测序读数并进行数据标准化[7–10]之后，对微生物组数据的探索性分析[5,6]通常从可视化多变量结构开始，以识别数据模式、区分变异或去除异常值。热图或条形图可以直接表示每个分类单元或特征的相对丰度。然而，对于包括高通量测序数据的大型数据集，通常需要统计排序分析来检测模式。生态学中最常用的排序方法[11]是多维缩放（MDS），这是一种在较低维度空间（例如二维或2D）中表示数据的同时保留其原始距离结构的排序技术（图1A）。这是通过最小化一个应力函数[12]来实现的，该函数定义为所有成对距离或差异的总和。使用这种差异度量对于找到这些稀疏或零膨胀组成的适当2D表示至关重要[13]，并且根据所选度量的不同，观察到了不同的模式[5,14]。在微生物组分析中的例子包括Bray-Curtis[15]和Unifrac[16,17]，它们结合了基于16S rRNA基因的分类信息以及组成结构。在这里，我们将这些基于距离的排序方法称为度量MDS。距离度量的应用使基于MDS的排序能够检测模式和环境梯度[18]，或进一步解决生物学混淆因素[19,20]。最近，另一种用于高维生物数据的可视化工具UMAP[21]也被应用于微生物组，以将特征与其在宿主体内的采样位置聚类[22]。

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图1. 用于微生物生态数据分析的F信息多维缩放（MDS）。
(a) 分析数据集的示意图，表示为具有S个特征或分类单元的N个样本的设计矩阵X。在平衡设计中，样本按相同的实验条件分组。注意，组成性要求跨特征的元素xij之和是固定的或与特征j无关（例如，1）。通过对X进行排序，然后进行统计推断，包括假设检验（例如PERMANOVA）或差异丰度分析。
(b) 使用标签集y降低X的维度以进行可视化的计算过程图，确保基于F统计量的推断结果的一致性。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014102.g001

评估排序或降维方法已经通过建立定量度量来促进，以评估它们的性能或适用于特定目标的适当性。这些评估使用广泛用于信息可视化的质量指标[23–25]来量化从原始结构中的信息变化或丢失，应用于单细胞基因组学[26]和转录组学[27,28]等生物学领域。这些指标评估局部模式的保留程度（例如，可信度、连续性[29]）或有多少成对距离从原始结构中发生扭曲（例如，Shepard图、标准化应力[30]）。然而，对于微生物组数据，评估主要集中在逐个案例识别群体聚类的能力上，使用诸如Rand指数[14]、k均值聚类[18,20]和F统计量[20,31]等度量。此外，还使用核回归[32]或基于秩的回归[18]分析了环境梯度模式。值得注意的是，大多数用于生态数据分析的排序方法不使用数据标签，而是依赖于未标记或未加权的距离进行计算。为了测试结构变化并将结果与处理效果相关联，需要额外的独立差异丰度分析[5,6]。虽然度量MDS可以检测到一些变化[33]，但其低维表示并不总是能捕捉到每个潜在模式——即使统计验证确认原始空间中存在这样的模式。只有当群体间的距离结构足够不同，以便清晰可视化时，模式在低维嵌入中才明显。在这种情况下，可以使用scree图分析来确定模式变得可见的维度。然而，scree图并不指示样本在这个降低维度内的分布情况。此外，如果所需的维度超过三个，度量MDS无法有效可视化群体之间的差异。这一限制推动了基于MDS的方法的发展，这些方法结合了额外的上下文信息以改进模式检测。一种广泛称为确认性MDS[34,35]的方法通过结合标签[36,37]来区分样本群体。这种方法通过优化目标函数的超参数调整来实现[20,37,38]。只要适应的表示与度量MDS表示没有显著偏差，通常就被接受，特别是考虑到MDS优化的是一个非凸函数并且可能产生不同的解决方案[39,40]。对于生物数据应用，引入了新的可视化方法来通过关于误差和协变量之间关系的某些假设[19]或通过将群体标签纳入潜在结构[20,41]来解决混淆因素。然而，将这些方法应用于通用微生物组数据集受到关于结构差异或数据模型的假设的限制，这些假设在现实世界场景中并不总是有效的。在这项工作中，我们提出了一种新的框架F信息MDS（F-MDS），旨在通过利用F统计量[图1B]在探索性MDS设置中可视化统计差异。我们的方法旨在对度量MDS表示进行最小干扰，尽可能保留全局距离结构。我们仅将干扰应用于度量MDS在原始数据结构下未能检测到统计显著群体差异的数据集。这推广了之前的基于标签和基于模型的MDS方法，消除了对群体结构或其差异的先验假设的需求。在以下部分，我们展示了F信息MDS如何产生较少依赖于超参数选择的表示，并评估了其与其他降维工具的性能比较。

方法
在本节中，我们回顾了多维缩放（MDS）的术语和定义，以及一个结合样本群体信息的监督变体的示例。接下来，我们提出了一种新的MDS方法，并讨论了通过排列（即PERMANOVA[42]）进行的多变量方差分析。最后，我们介绍了评估降维工具的质量指标，并将其与提出的MDS方法进行了比较。

多维缩放方法回顾
我们考虑一个平衡设计，其中第i个样本表示为，是S维的，并与离散标签相关联，代表G个群体，对于每个索引（样本数量，图1A）。xi和xj之间的成对距离表示为，使用任意的差异度量（如欧几里得、Bray-Curtis[15]或UniFrac[16]）来计算。让D = [dij]表示成对距离矩阵。在度量多维缩放中，目标是找到一个最佳保留原始距离结构D的二维表示。这是通过最小化一个目标函数（称为原始应力[30]）来实现的，(1)
已知的用于最小化原始应力的算法包括通过Nystr?m近似[43]进行矩阵分解、对于欧几里得距离使用分而治之[44,45]，或者对于非凸函数使用贪婪算法[39]，如最大化[12,46]或随机梯度下降[40,47,48]。虽然度量MDS是一种无监督学习，不需要标签集，但监督版本的多维缩放（如SuperMDS[38]）通过对表示施加额外约束来对样本进行分类。目的是根据标签对样本进行分类，并计算多维缩放。这是通过在原始应力中添加一个确认性或约束项来实现的，(2)其中确认性项涉及群体标签。这两个项通过一个超参数进行平衡，该超参数控制分类的程度。最小化可以使得位于同一组内的表示点彼此更接近。超参数的选择由数据结构仔细指导，以便在可视化过程中避免不必要的群体区分。

基于伪F统计量的多维缩放提案
在这里，我们引入了一个基于样本分散度的多变量数据测试统计量（即F统计量），并提出了一个利用该统计量的修订后的MDS框架。通过排列多变量方差分析。

在多变量数据中测试群体差异通常是通过计算F统计量来执行的，该统计量基于成对距离比较组间和组内方差。然而，标准的F检验假设观测值呈正态分布且方差相等，这一假设不适用于大多数组合性或零膨胀数据。相反，已经定义了一个“伪”F统计量[49]，通过表示指示函数来写（3）对于足够大的数据集，伪F统计量的经验分布通过标签排列来近似[13,50]。具体来说，K个独立排列生成排列的标签集，从中计算值。然后使用这个伪F分布来获得p值，这个过程称为排列多变量分析（PERMANOVA）[42]：(4)

为了将假设检验纳入MDS分析，我们开发了一种弱监督学习方法（图1B）。首先，通过计算度量MDS（即无监督步骤）初始化一个二维表示。接下来，迭代调整表示点，以便在2D空间中计算的p值与原始PERMANOVA p值匹配。这是通过在原始应力中添加一个新的确认性项来实现的，(5)其中确认性项最小化了每个空间中获得的排列F分布的p值之间的差异，即原始空间和二维空间（分别表示为Fx和Fz）。由于两个F比率的比例尺度不同，我们引入了一个局部回归函数fz来在它们之间进行映射（算法1）。此外，在回归之前，每个比率都是使用一组排列的标签迭代计算的，并且得到的值按照大小进行了排序。这使得原始的F比率（来自未排列的标签）能够在二维空间中被精确映射。映射函数的详细信息和精确推导过程在附录A，S1文件中给出。算法1：用于在Fx和Fz之间映射的回归函数fz。要求：成对距离；标签或组；确保：1：空列表；2：空列表；3：对于...执行以下操作；4：对y进行随机排列；5：使用D和...计算伪F；6：使用Z和...计算伪F；7：将...添加到...；8：将...添加到...；9：结束循环；10：按升序排序；11：按升序排序；12：在...之间进行局部回归。我们实现了最大化（或最大化-最小化）算法来最小化F-MDS目标（方程5）。首先，推导出了一个精确的形式来匹配每个项的物理维度（附录A，S1文件，（6）；接下来，如[30,38]中所述，应用最大化来寻找每个...的最优第k个点，同时保持其他点不变：（7）可以分析证明，方程7可以用zk的二次表达式来最大化，然后通过对zk的每个元素求导（表示为zks，s=1,2）来进一步最小化。通过将导数设为零来建立更新规则。应当注意的是，更新仅应用于在其原始结构下组间差异显著的表示（px<0.1），但在二维嵌入中未被识别。更新的设计目的是持续进行，直到px和pz之间的差异最小化。Z的表达式和更新规则的详细推导在附录B，S1文件中描述，总结在算法2中。算法2：用于计算F-MDS的更新规则。要求：成对距离；标签或组；确保：2D表示；1：使用D和y计算伪F（方程3）；2：X中组差异的p值；3：Z中组差异的p值；4：当...时执行以下操作；5：Z中组差异的p值；6：对于...执行以下操作；7：确认项的符号（方程S13）；8：映射函数（算法1）；9：使用...和...更新zk（方程S16）；10：结束循环；11：Z中组差异的p值；12：结束循环。数据集和评估：使用半合成数据通过模拟研究来说明F信息MDS的行为，这些模拟数据集旨在模仿微生物群落。在十一个可用的模拟包[51]中，选择了SparseDOSSA [52]，因为它能够捕捉生态结构的关键特征，包括组成性、稀疏性和特征间的相关性。SparseDOSSA是一个贝叶斯模型，其中微生物基因特征的测序计数遵循多项式分布，其概率等于相应特征的相对丰度。相对丰度是通过归一化绝对丰度（表示为as）获得的，每个绝对丰度近似遵循零膨胀的对数正态分布。具体来说，as的边际规范是（8），其中p_s是特征s缺失的概率，μ和σ分别是经过对数转换的非零特征丰度的均值和标准差。此外，SparseDOSSA中特征之间的依赖性是通过copula参数间接处理的。该参数描述了一个潜在的多变量高斯变量，与...进行比较以确定特征是否存在。在模拟研究中，通过将模型拟合到健康人类粪便的shotgun测序宏基因组（“stool”[53]）来估计SparseDOSSA参数，然后进行均值调整。训练集包含239个粪便样本，每个样本包含332个微生物特征。对于二元组模拟（即y=1,2），使用拟合的粪便参数生成了两个平衡的半合成数据集，每个数据集的所有特征均值都进行了不同的调整。具体来说，选择了具有最小“有效”方差的特征s1（方程9）；然后在该特征的均值上加上一个偏移值（方程10）。（9）（10）同样，对于三元组模拟（y=1,2,3），使用拟合的SparseDOSSA参数生成了三个平衡的半合成数据集，对五个特征的均值进行了不同的调整（方程11）。再次，从332个特征中选择了具有最小有效方差的特征。（11）总之，调整了粪便训练的SparseDOSSA模型，以说明在二维表示中度量MDS未能揭示基于组的模式的情况。调整旨在尽可能真实地捕捉微生物组特征。对于二元数据集，使用半合成数据集和超参数评估了F信息MDS。基于原始结构的Bray-Curtis差异计算两个样本之间的成对距离，以及在2D表示上的欧几里得距离。对于每种设置，生成了三个重复的数据集。真实的微生物群落：我们还使用与宿主相关或从宿主体内采样的细菌群落数据评估了F信息MDS，包括一种光合硅藻[54]和人类肠道，后者用于研究肝硬化[55]或2型糖尿病（T2D）[56,57]。对于与藻类相关的微生物组，数据集包括36个平衡的微生物群落样本，这些样本是在有或没有微生物宿主（Phaeodactylum tricornutum）的情况下培养的。该群落由16S rRNA基因的扩增子序列变体（ASV）鉴定出的72个细菌分类单元组成。ASV计数是通过Illumina MiSeq系统获得的，随后使用累积和缩放（CSS）[10]转换为相对丰度。使用基于系统发育的度量（加权Unifrac [17]）来计算样本之间的成对距离。对于人类肠道微生物组，从公开可用的存储库[58]中检索了两个来自shotgun宏基因组测序的数据集，其中读段在属级别进行了合并[59]。这些数据集的详细复制和处理步骤在附录D，S1文件中描述。性能评估指标：为了量化降维的性能，定义了四个已知的[25]和两个新的质量指标，并共同使用。前四个指标中的可信度和连续性衡量了邻域点从原始（S-）到二维表示的保留程度，或者反之亦然，定义在[29]中：（12），其中k是感兴趣的邻域大小，rij和r_j分别是j点在原始和/或二维空间中相对于i点的基于距离的排名。通过遵循...和...构建集合Uk（i）和Vk（i），其中Ck（i）和Vk（i）分别是原始空间和二维空间中最接近i点的k个点的集合。应用了两个不同的k值，分别对应于...和数据大小的75%，以评估在模拟和真实数据集中保留的局部和全局信息。可信度和连续性是使用R包drevval（v.0.1.5 [60]）计算的。此外，我们通过计算两个指标来量化表示Z与原始距离D的偏差程度；第一个是“标准化”应力或Stress-1 [30]，（13），第二个使用Shepard图[61]及其皮尔逊相关系数。这两个指标提供了每种降维方法在表示中发生的原始全局结构的扭曲程度。还定义并使用了两个新的指标，我们称之为F相关性和F排名比率（14），其中...表示两个随机变量之间的皮尔逊系数，上标表示组标签y的排列。实验是在Apple M3芯片上使用RStudio进行的，该芯片配备了16 GB的RAM，或者在MIT研究计算和数据中心的128线程IBM POWER9 CPU上进行的，配备了256 GB的RAM。数据集在Dryad上公开可用，网址为https://doi.org/10.5061/dryad.vmcvdnd3x [62]。结果：F信息MDS对超参数的选择具有鲁棒性。我们首先通过观察一系列超参数下MDS表示的变化来表征F信息MDS的行为。在每次更新表示Z之后，通过计算目标函数和从Z的测试中得到的PERMANOVA p值pz来记录变化。选择p值作为跟踪度量，而不是伪F统计量（附录A，S1文件）。为了生成数据，使用SparseDOSSA [52]模拟了大小从50到500的二元、平衡的数据集，这是一个捕捉微生物群落主要特征的贝叶斯模型。统计模型是使用239个人类粪便衍生的群落样本和332个微生物物种[53]进行训练的，然后对一个特征进行了均值调整以反映组间差异（见“半合成数据”部分）。模拟结果的热图及其直方图确认数据被稀疏地标准化了（S1A和S1B图）。使用主坐标分析获得的二维表示显示组间差异无法区分（S1C图）。实际上，使用欧几里得距离对度量MDS表示进行的PERMANOVA测试没有检测到统计学上的显著差异（pz>0.51），而原始数据结构确实显示了显著差异（px<0.05，表1）。下载：PPT PowerPoint幻灯片PNG更大图像TIFF原始图像表1。使用原始结构（px）和主坐标分析表示（pz）的半合成数据集中组差异的PERMANOVA测试结果。数据集是使用SparseDOSSA [52]生成的（方法中的“半合成数据”部分）。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014102.t001。跟踪F-MDS表示在训练周期中的变化表明，需要一个最小的超参数值和一个停止规则来最小化目标函数（图2A）。在使用SparseDOSSA生成的半合成数据集中，我们观察到pz值和随时间逐渐减小。当训练在没有停止规则的情况下继续进行时，pz值在0和1之间振荡，较大的k值时振荡率更高（S2A图）。因此，我们指定了一个有界区域，作为终止最大化算法的停止标准。根据这个规则，当...时，算法在少于30次迭代中停止（图2B）。在大小不同的三个重复模拟数据集上重复实验，确认了...是终止所需的最小值（S2B图）。为了保持具有正二次系数的最大化形式的凸性，超参数被限制在不超过1的值（图2C和附录B，S1文件）。下载：PPT PowerPoint幻灯片PNG更大图像TIFF原始图像图2。最大化算法优化F信息MDS目标函数。（A）包括原始应力和确认项在内的目标函数（方程5）的每个项的变化，针对不同的超参数值绘制在训练周期上。使用SparseDOSSA [52]生成了一个N=200，重复1的半合成数据集（见方法中的“半合成数据”部分）。（B）在满足停止标准之前，二维表示下的PERMANOVA p值（pz）随周期和...绘制。（C）直到终止的周期数随超参数变化绘制，范围在0.2到1之间。误差条表示重复实验的标准差。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014102.g002。在确认不同超参数下目标函数最小化后，我们接下来询问这些F-MDS值是否影响其2D表示。使用Shepard图和Stress这两个常用的质量指标来评估MDS表示保留原始维度距离结构的程度（见方法）。选择监督MDS（superMDS [38]作为基准排序方法，因为其目标函数同样由同一范围内的单个超参数[0,1]控制，确保其最大化算法的性能。对这些MDS方法的Shepard图分析显示，当使用非零超参数时，二维表示中的成对欧几里得距离与原始结构的偏差更大。然而，有趣的是，F-MDS中的变化更为微妙（图3A和S3A）。下载：PPT PowerPoint幻灯片PNG更大图像TIFF原始图像图3。F信息MDS对超参数的选择具有鲁棒性。（A）Shepard图比较了F信息MDS（F-MDS）和监督MDS（superMDS）在零（度量MDS）和非零超参数设置（,...）下的成对距离。原始高维空间中的距离是使用Bray-Curtis差异计算的；二维嵌入中的距离使用欧几里得度量。（B）对于每种方法，计算了原始距离和嵌入距离之间的皮尔逊相关系数。（C）为每个嵌入计算了标准化应力（Stress-1）。分析使用了包含200个样本的半合成数据集（详见方法部分中的“半合成数据”章节）。误差条表示三个数据集的标准差。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014102.g003 为了进一步比较结构偏差，我们根据Shepard图计算了皮尔逊相关系数以及标准化应力（即Stress-1，公式13）。在F-MDS中，所有测试值的相关性始终保持在较高水平，而随着超参数的增加，superMDS的相关性系数下降到0.1以下（见图3B和S3B）。同样，由于超参数的增加，superMDS中的Stress-1增加幅度是F-MDS的19.1倍（见图3C和S3A）。结合之前的结果，这些发现证实了所提出的方法在保留原始距离信息方面与度量MDS一样有效，同时对超参数的依赖性更低。同时，它成功地重新排列了2D结构，使得各组在统计上变得明显不同。基于超参数对MDS配置的影响，进行了网格搜索以确定最优值。先前的分析表明，较大的超参数值可以加快F-MDS的优化速度（见图2C）。为了在平衡迭代次数和结构偏差的同时减少不同指标之间的偏差，我们通过最小-最大标准化定义了一个目标函数（附录C，S1文件）。损失函数在0.15到1的范围内进行了评估，性能得到了保证（见S4A图）。在半合成数据集中，最小化该值的超参数大于或等于0.5（见S4B图）。使用不同的质量指标进一步证实了F-MDS的一致性能。我们之前的研究已经证明，F-informed MDS能够有效地在2D空间中表示距离结构。接下来，我们通过将F-MDS与其他降维方法进行比较来推广我们的统计方法，因为最近的例子表明这些方法也可以用于可视化微生物组数据。为了更全面地评估每种排序方法，我们引入了四个质量指标（详见方法部分中的“性能评估指标”）。前两个指标——可信度和连续性[29]——衡量了2D表示中保留局部邻域结构的程度（公式12）。虽然这些指标不需要组标签，但它们已被用于评估基因表达分析方法[63,64]。另外两个指标评估了从原始多维结构派生的伪F分布与2D表示之间的相似程度（公式14）。首先，F相关性衡量了两个F比率之间的皮尔逊相关性：一个是从原始数据的距离结构计算得出的，另一个是从使用排列标签的2D表示计算得出的，如[65]中所述。每对F比率都是通过单次排列获得的，进行了500次排列来计算F相关性系数。较高的F相关性值表明排序方法在低维空间中成功重建了相似的分布模式。其次，F-rank-ratio定义为未排列标签下的F的逆序排名与通过K次排列得到的有序F集合的排名之比。这个比率对于原始表示和2D表示都进行了计算。接近1的F-rank-ratio表明排序方法准确保留了原始结构中呈现的组间统计显著性。结合这些指标，我们评估了排序方法是否在保留原始伪F分布的同时也保留了组间的统计差异。使用六个质量指标，评估了F-MDS的性能，并将其与其他排序方法进行了比较，包括度量MDS、UMAP [21]、t-SNE [66] 和 Isomap [67]。首先使用半合成数据集在一系列超参数下计算这些指标。我们观察到，在局部邻域保留方面，即7%的数据大小，无监督UMAP（UMAP-U）获得了最高的可信度得分，其次是t-SNE、有监督UMAP、（F-）MDS和Isomap（见图4A和S5A）。虽然无监督和有监督UMAP都表现出较高的可信度（>0.73），但后者显示出较低的连续性，这表明在引入组标签后，2D表示中引入了额外的约束。相比之下，F-MDS在保持较高可信度的同时，连续性也相对较高。总体而言，UMAP-U最好地保留了这些模拟数据的局部邻域信息，而我们的方法在依赖超参数方面表现相当。下载：PPT、PowerPoint幻灯片、PNG、较大图像、TIFF、原始图像。图4. 不同的质量指标证实了F-informed MDS在保留半合成数据模式方面的一致性。评估了六种降维方法，通过计算可信度和连续性来测试它们对（A）局部和（B）全局结构的保留能力，使用的最近邻数分别为k=14（局部）和k=150（全局）。这些方法还使用了（C）全局失真指标（Stress-1和Shepard图相关性）以及（D）统计推断指标，包括统计显著性比率（F-rank-ratio）和F比率相关性（F-correlation），使用随机排列的标签集。以下超参数应用于每种方法：（F-MDS）、邻居数量n（UMAP，有监督（-S）和无监督（-U））、困惑度“perp”（t-SNE）以及最短差异数量n（Isomap）。如方法部分“半合成数据”所述，生成了三个包含200个样本的半合成数据集。计算了标准差，并用误差条显示。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014102.g004 对于全局结构保留，基于MDS的排序方法（例如度量MDS、F-MDS、Isomap）如预期般表现最佳，当使用相同的两个指标但邻域范围更广（75%的数据大小，见图4B和S5B）或基于距离的指标（如成对距离相关性（Shepard图）或Stress-1）进行评估时也是如此。后两个指标显示，基于图的方法（如UMAP和t-SNE）的Stress-1值始终高于MDS方法（见图4C和S5C）。这一发现证实，与度量MDS相比，F-MDS没有显著改变全局数据结构。最后，应用基于F的指标来评估这些排序方法在低维空间中表示距离结构的能力（见图4D和S5D）。包含组标签的方法，如F-、superMDS和有监督UMAP（UMAP-S），其F-rank-ratio值接近于1，表明它们的2D表示中准确保留了组间差异。接下来，我们分析了另一个真实的微生物群落作为示例，以验证这些排序方法的性能。每个样本基于16S rRNA基因表达呈现了相对丰度的组成结构，识别了从藻类P. tricornutum的生态系统中收集的72个细菌分类单元[68,69]。从之前的工作中检索并重新分析了36个群落样本，其中一半与宿主P. tricornutum共培养，另一半则没有（方法部分“真实微生物组群落”）。选择这个数据集作为我们的主要分析和评估对象，因为度量MDS没有检测到组间差异（），而它们的原始结构在统计上更为不同（px<0.1）。其他基准数据集，例如人类肠道微生物组，不需要额外的F-MDS迭代，因为度量MDS已经显示出了显著差异（pz=0.004，肝硬化；0.004，2型糖尿病）。对于所有数据集，选择了加权Unifrac [17]作为距离度量来获得距离结构。再次使用六个质量指标来比较七种降维方法，包括基于自监督学习的方法（SimCLR [70]），以进一步探索其排列藻类微生物组数据以供解释的能力（附录E，S1文件）。同样，UMAP-U和Isomap在保留局部邻域方面获得了最高分数，略微优于F-MDS。然而，其他有监督或包含标签的方法的连续性得分比Isomap低22-44%（见图5A）。然而，对于全局结构保留，F-MDS、度量MDS和Isomap基于两个指标以及成对距离相关性（见图5B、5C和S6）都是表现最好的。最终，统计评估显示F-MDS在其低维表示中再次有效地保留了统计显著性和F分布（见图5D和S7）。虽然SimCLR的F-rank-ratio接近于1，与其他有监督排序方法相当——表明其聚类这些数据的分类准确性很高——但其保留局部和全局结构的得分在所有排序方法中最低。综合这些多次评估，F-MDS在表示生态数据的整体排序和基于组的模式方面最为适合，而其在局部结构表示方面的能力与UMAP相当。下载：PPT、PowerPoint幻灯片、PNG、较大图像、TIFF、原始图像。图5. 不同的质量指标证实了F-informed MDS在保留藻类微生物组模式方面的一致性。评估了七种降维方法，通过计算可信度和连续性来测试它们对（A）局部和（B）全局结构的保留能力，使用的最近邻数分别为k=3（局部）和k=27（全局）。这些方法还基于（C）全局失真指标（Stress-1和Shepard图相关性）以及（D）p值比率（F-rank-ratio）和F比率相关性（F-correlation）进行了评估，使用随机排列的标签集。应用了以下超参数：（F-MDS）、邻居数量n（UMAP，有监督（-S）和无监督（-U））、困惑度“perp”（t-SNE）以及最短差异数量n（Isomap）。如方法部分“半合成数据”所述，生成了三个包含200个样本的半合成数据集。计算了标准差，并用误差条显示。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014102.g005 对于全局结构保留，基于MDS的排序方法（例如度量MDS、F-MDS、Isomap）是表现最好的，当使用相同的两个指标但邻域范围更广（75%的数据大小，见图4B和S5B）或基于距离的指标（如成对距离相关性（Shepard图）或Stress-1）进行评估时也是如此。后两个指标显示，基于图的方法（如UMAP和t-SNE）的Stress-1值始终高于MDS方法（见图4C和S5C）。这一发现证实，与度量MDS相比，F-MDS没有显著改变全局数据结构。最后，应用基于F的指标来评估这些排序方法在低维空间中表示距离结构的能力（见图4D和S5D）。包含组标签的方法，如F-、superMDS和有监督UMAP（UMAP-S），其F-rank-ratio值接近于1，表明它们的2D表示中准确保留了组间差异。相比之下，无监督方法和旨在保留距离结构的方法（如度量MDS、Isomap和F-MDS）的F相关性更高，这与之前的成对距离相关性观察结果一致。接下来，我们分析了另一个真实的微生物群落作为示例，以验证这些排序方法的性能。每个样本基于16S rRNA基因表达呈现了相对丰度的组成结构，识别了从藻类P. tricornutum的生态系统中收集的72个细菌分类单元[68,69]。从之前的工作中检索并重新分析了36个群落样本，其中一半与宿主P. tricornutum共培养，另一半则没有（方法部分“真实微生物组群落”）。选择这个数据集作为我们的主要分析和评估对象，因为度量MDS没有检测到组间差异（），而它们的原始结构在统计上更为不同（px<0.1）。其他基准数据集，例如人类肠道微生物组，不需要额外的F-MDS迭代，因为度量MDS已经显示出了显著差异（pz=0.004，肝硬化；0.004，2型糖尿病）。对于所有数据集，选择了加权Unifrac [17]作为距离度量来获得距离结构。再次使用六个质量指标来比较七种降维方法，包括基于自监督学习的方法（SimCLR [70]），以进一步探索其排列藻类微生物组数据以供解释的能力（附录E，S1文件）。同样，UMAP-U和Isomap在保留局部邻域方面获得了最高分数，略微优于F-MDS。然而，其他有监督或包含标签的方法的连续性得分比Isomap低22-44%（见图5A）。然而，对于全局结构保留，F-MDS、度量MDS和Isomap基于两个指标以及成对距离相关性（见图5B、5C和S6）都是表现最好的。最后，统计评估显示F-MDS在其低维表示中再次有效地保留了统计显著性和F分布（见图5D和S7）。虽然SimCLR的F-rank-ratio接近于1，与其他有监督排序方法相当——表明其聚类这些数据的准确性很高——但其保留局部和全局结构的得分在所有排序方法中最低。总体而言，这些多次评估表明F-MDS在表示生态数据的整体排序和基于组的模式方面最为适合，而其在局部结构表示方面的能力与UMAP相当。下载：PPT、PowerPoint幻灯片、PNG、较大图像、TIFF、原始图像。图5. 不同的质量指标证实了F-informed MDS在保留藻类微生物组模式方面的一致性。评估了七种降维方法，通过计算可信度和连续性来测试它们对（A）局部和（B）全局结构的保留能力，使用的最近邻数分别为k=3（局部）和k=27（全局）。这些方法还基于（C）全局失真指标（Stress-1和Shepard图相关性）以及（D）p值比率（F-rank-ratio）和F比率相关性（F-correlation）进行了评估，使用随机排列的标签集。分析了N=36个细菌群落的数据集，如方法部分“真实微生物组群落”所述。应用了以下超参数：（F-MDS）、邻居数量nU（UMAP，有监督（-S）和无监督（-U））、困惑度“perp”（t-SNE）以及最短差异数量nI（Isomap）。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014102.g005 F-MDS调整了组簇以可视化统计差异。在使用不同的质量指标评估F-MDS之后，我们应用该方法来了解样本组在2D表示中的区分情况。之前描述的半合成和细菌群落数据集被用于可视化，注意到使用度量MDS的2D表示中它们的组间差异无法区分（），而在原始维度中，它们在统计上更为明显（px<0.1）。为了检测这些表示中的结构变化，使用不同的超参数生成了度量MDS和F-MDS的可视化结果，并通过计算每个组的中心距和方差进行了比较。对于模拟数据集，我们观察到当超参数从零增加到一时，组中心点发生了位移，这种位移是单向的，并将组分开（见图6）。在较低的超参数值下，组间中心距的增加更为明显，增加率比在高超参数值时高出1.9-25.7倍（见S8图）。这一发现表明，受最大化约束的MDS表示的重新排列在高超参数值时减速并稳定下来。这与我们之前的迭代次数分析一致（见图2），其中计算迭代次数达到最小值，当超参数达到1时满足了目标。此外，我们还观察到随着超参数从0增加到1，每个组的方差稳步减小（见S8图），这是通过它们的协方差的特征分解测量得出的。这表明F-MDS通过减少各自的方差进一步区分了组间差异。下载：PPT、PowerPoint幻灯片、PNG、较大图像、TIFF、原始图像。图6. F-informed MDS可以可视化基于组的数据区分。使用度量MDS和F-informed MDS（F-MDS）生成的（A）模拟数据集和（B）藻类微生物组数据的二维表示，使用了两种超参数设置（0.5, 1）。相应颜色的椭圆以0.68的置信水平绘制。https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014102.g006 在细菌群落数据集中也观察到了类似的趋势，其中非零超参数下的组间中心距大于使用度量MDS时的中心距（见图6B）。然而，由于变异性（p=0.521，Spearman相关性，S8D图），相关性没有显示出统计显著性。每个2D组表示的主要（长轴）方差也分别减少了24%和18%（见S8E图），而在次要（短轴）方差中的减少则不那么明显（见S8F图）。进一步比较不同超参数下的2D表示显示，样本分布保持相似，表明F-MDS仍然没有显著改变度量MDS的配置。为了验证F-MDS是否可以应用于包含两个以上组的数据集，我们还考虑了一个包含三个组的数据集，其中每个样本组遵循不同的零截断对数正态分布（公式11，S9图）。与之前的二元模拟数据集类似，该分布呈椭圆形，导致在度量MDS中的表示无法区分（pz=0.965），而原始结构在统计上有所不同（px=0.053）。使用超参数计算F-MDS显示，样本组之间出现了差异，当绘制置信水平为68%的椭圆时，这些差异变得更加明显（见图7）。尽管这种偏差导致了统计上显著的二维表示（pz = 0.001），但与二元数据表示相比，三元类别设置使得差异不那么明显。下载：PPT、PowerPoint幻灯片、PNG格式的大图、TIFF格式的原图。图7：基于统计推断对多类数据进行区分。使用四维、三类模拟数据集比较了MDS和F-informed MDS的可视化结果。每个数据集组都遵循具有相同协方差但不同均值的正态分布（见S9图）。相应颜色的椭圆以0.68的置信水平绘制。生成了一个包含75个样本的半合成数据集（详见“方法”部分中的“半合成数据”）。链接：https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1014102.g007

讨论
在这项工作中，我们提出了一种基于F比值的弱监督多维缩放方法，并通过改变超参数和最大化算法的迭代次数来表征其表示效果。使用模拟数据和细菌群落数据集进行的评估表明，我们的F-informed MDS在保留局部和全局结构以及基于类别的信息（例如统计推断）方面优于现有的基于MDS的其他降维方法。本研究中使用的数据集代表了那些通过可视化无法识别群体差异的情况，部分原因是由于降维过程中丢失了这些信息。我们基于分散度的方法通过引入一个额外的约束来最小化表示的调整，同时直接实现了与群体相关的推断。例如，在微生物组研究中，将F-informed MDS应用于细菌群落数据集可以使用户更自信地解释生物学上有意义的模式。该方法也可能应用于其他基于距离度量处理多变量信号的领域，如代谢组学数据聚类[71]、结合空间神经成像的网络连通性分析[72]或药物质量控制的谱分析[73]。然而，F-informed MDS的一个局限性是其计算依赖于MDS的初始配置，并且随着最大化迭代和标签排列次数的增加，计算成本也会增加（方法成本的总结见附录F，S1文件）。实际上，MDS的最大化过程以其高计算成本而闻名[48]，尽管其数值收敛性是有保证的[74]，并且在我们的模拟中并未观察到任何稳定性问题。最近在计算算法方面的理论进展，包括最大化[75]或（随机）梯度下降[39,40]，为改进我们的框架以实现不受限制的初始化和更高效的迭代提供了可能性。此外，实证观察表明，在较高超参数值下，F-MDS的表示对超参数的选择依赖性降低。一旦明确了构成两个目标的术语之间的关系，就可以找到一种无需递归程序（如交叉验证）即可选择最优超参数的可行策略。总之，所提出的F-MDS为可视化高通量微生物组数据提供了有用的工具，同时提供了统计测试结果。我们预计这种方法将有助于微生物学和生态数据分析的更广泛应用。F-MDS的R语言实现可在https://bioconductor.org/packages/FinfoMDS/获取。

致谢
作者感谢MIT研究计算与数据办公室提供的高性能计算资源，这些资源对本文报告的研究结果做出了贡献。我们感谢C. Belthangady和J.-Y. Lee在开发神经网络模型方面的指导，以及T. Sapsis和R.D. Braatz的建议。