温度引起的Antheraea pernyi蛹期色素沉着受ApADC的影响，这种影响是通过调节NBAD的生物合成实现的

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Temperature-induced pupal pigmentation in Antheraea pernyi is affected by ApADC through the regulation of NBAD biosynthesis

温度依赖性调控鳞翅目昆虫色素沉积的分子机制研究，发现ApADC基因通过调节β-丙氨酸合成影响黄黑色素沉积，并建立首个家蚕基因组CRISPR/Cas9平台。

　　

王琪|唐静文|江云敏|江雪莹|王勇|刘伟|秦莉

沈阳农业大学生物科学与生物技术学院，中国沈阳110866

摘要

中国橡树蚕（Antheraea pernyi）的蛹期色素沉着具有温度依赖性：在23°C时形成黑色蛹，在29°C时形成黄色蛹。为了解释这一现象，我们通过整合多组学分析、RNA干扰和CRISPR/Cas9技术，阐明了这种表型可塑性的分子机制。我们发现< />A. pernyi的天冬氨酸1-脱羧酶（ApADC）和NBAD合成酶（Apebony）的表达受到温度调控。这种调控与黄色蛹中β-丙氨酸/天冬氨酸含量的增加以及黑色蛹中多巴胺/N-乙酰多巴（NADA）含量的增加相关。在18°C下注射β-丙氨酸可诱导蛹向黄色转变；而在29°C下敲低ApADC或Apebony的表达则会导致黑色素沉着。通过建立首个针对A. pernyi的CRISPR/Cas9平台，我们生成了GadA结构域受损的ApADC突变体，这些突变体即使在29°C条件下也会形成黑色蛹；该表型可通过补充β-丙氨酸得到恢复。我们的结果表明，ApADC通过调节NBAD的生物合成，成为调控蛹期色素沉着的关键因子。这些发现为鳞翅目昆虫的黑色素沉着和环境适应性提供了分子机制上的见解，并有望指导A. pernyi产业的稳定遗传品系的定向育种。

引言

昆虫体色是一种重要的生态适应特征，在生理过程中起着关键作用，如体温调节、伪装、警戒（拟态）、水分保持、紫外线防护和免疫防御（Wittkopp等人，2009；Badejo等人，2020；Tong等人，2021）。环境温度是驱动昆虫体色表型可塑性的关键非生物因素（Britton等人，2023）。为了应对自然气候变化，昆虫进化出了发育可塑性，通过调节角质层色素沉积量来控制对太阳辐射的热吸收（Sharma等人，2016；Galván等人，2018；Clusella-Trullas等人，2020；Moreno Azócar等人，2020）。这种表型多样性在多种昆虫中都有报道：例如，瓢虫Harmonia axyridis在高温下会形成较浅的斑点（Michie等人，2010），而某些蝴蝶物种和Drosophila melanogaster在低温环境下会显著增加黑色素沉积（Solensky和Larkin，2003；Gibert等人，2018；Lafuente等人，2024）。在10°C下饲养的D. suzukii“冬季型”个体比在25°C下饲养的“夏季型”个体体型更大、颜色更深，并且据报道能在1°C下存活数月（Shearer等人，2016）。在经济上重要的中国橡树蚕Antheraea pernyi中，蛹期的颜色对温度的强烈依赖性尤为显著：夏季高温会形成黄色蛹，而秋季低温则形成黑色蛹。由于消费者认为黄色蛹品质更优，因此黄色蛹在市场上价格更高（Li等人，2020）。

昆虫体色是一种复杂的表型特征，由遗传基础、激素调节和环境因素的协同作用共同决定（Michie等人，2011；Sun等人，2018）。其中，角质层中的黑色素沉积是决定体色多样性的关键生理过程（Arakane等人，2009）。通过对D. melanogaster等模式生物的研究，人们发现了昆虫黑色素生物合成途径的保守性。该途径始于氨基酸酪氨酸，酪氨酸首先被酪氨酸羟化酶（TH）羟基化为多巴（Dopa），随后被多巴脱羧酶（DDC）脱羧生成多巴胺。多巴胺在色素合成中起着关键作用：在漆酶2（Lac2）和黄色家族基因产物的作用下，它可以进一步通过多巴途径或多巴胺途径聚合，分别形成黑色（多巴-黑色素）或棕色（多巴胺-黑色素）色素（Arakane等人，2009；Noh等人，2016；Matsuoka等人，2018）。例如，在Tribolium castaneum中，Yellow-y和Yellow-e基因参与黑色素合成（Arakane等人，2010）；而在Bicyclus anynana中，yellow基因突变会导致黑色鳞片变为黄褐色（Matsuoka等人，2018）。另一种途径是，多巴胺作为初级色素前体，与β-丙氨酰多巴合成酶（ebony）反应生成< />β-丙氨酰多巴的生物合成严格依赖于天冬氨酸1-脱羧酶（ADC对天冬氨酸的脱羧作用（Mun等人，2020）。由于β-丙氨酰多巴是ebony介导的NBAD合成的底物，因此ADC的酶活性是NBAD途径中的关键限速步骤，决定了角质层色素的沉积模式。

大量证据表明ADC在昆虫色素沉着中起着关键作用，并暗示其可能具有温度响应性：在D. melanogaster中，black基因（编码ADC）的功能丧失突变会导致角质层变暗（Phillips等人，2005）。同样，T. castaneum的经典黑色突变体和Bombyx mori的黑色蛹(bp)突变也归因于ADC缺陷（Arakane等人，2009；Dai等人，2015）。在T. castaneum和B. mori中，通过RNA干扰（RNAi）下调ADC的表达可重现黑色素沉着表型（Dai等人，2015；Perkin等人，2017）。对B. mori bp突变体的分子分析显示，在BmADC启动子下游聚集有11个潜在的热休克因子（HSF）结合位点，这表明ADC的表达受到温度的直接调控（Dai等人，2015）。其他黑色素途径基因也表现出环境响应性，例如Papilio xuthus幼虫中ebony/tan的节段特异性表达（Futahashi等人，2010），Drosophila和Tribolium中ebony功能丧失会导致黑色素沉着，以及Drosophila tan突变体角质层变浅（Kohn等人，2007；Tomoyasu等人，2009）。这些发现突显了该途径的复杂调控机制。然而，尽管ADC在黑色素沉积中的功能具有保守性，并且被认为与温度敏感性有关，但其在鳞翅目昆虫中温度响应性蛹期色素沉着中的直接实验验证仍缺乏。这对于经济价值较高的A. pernyi尤为重要。

在这项研究中，我们旨在阐明A. pernyi中温度响应性黄色色素沉着的分子机制，重点关注A. pernyi ADC（ApADC）的作用。我们结合多组学分析（转录组学和代谢组学）和CRISPR/Cas9介导的ApADC敲除实验，直接验证了其在A. pernyi中温度响应性蛹期色素沉着中的核心调控作用。总体而言，我们的结果揭示了一种新的温度响应性机制，用于调控鳞翅目昆虫的蛹期色素沉着。此外，CRISPR/Cas9技术首次应用于A. pernyi的蛹期黑色素沉着研究，为培育具有稳定黄色蛹的新品种奠定了基础。

研究片段

昆虫采集与样本收集

A. pernyi这种双代昆虫的“Xuanda No. 1”品系由Tussah研究所保存。幼虫在第五龄末期开始食用新鲜的Quercus wutaishanica叶片，直至开始结茧。处于相同发育阶段的新生蛹被转移到气候控制室中。实验条件为四种温度（18、23、26和29°C），相对湿度为60±10%，光照周期为12小时光照：12小时黑暗。

不同温度条件下从预蛹到蛹的形态变化

在自然条件下，A. pernyi的结茧幼虫在10–14天内完成蛹化。夏季的高温促进黄色蛹的形成，而秋季的低温则形成黑色蛹（图1A）。在蛹化前约16小时，幼虫角质层的颜色从深绿色变为黄绿色，并形成新的角质层。在蛹化前4小时，下层蛹皮的色素沉着变得可见。

讨论

我们的RT-qPCR分析确定了A. pernyi蛹色决定的关键时间窗口：从蛹化前16小时（新角质层合成开始）到蛹化后12小时（色素沉着稳定阶段）（图1，S1）。在此窗口内，A. pernyi的蛹色从18°C时的完全黑色逐渐变为26°C时的斑驳状，最终在29°C时变为完全黄色，为热诱导的黑色素沉着假说提供了新的实验证据。该假说认为……

结论

本研究首次在野生丝蛾A. pernyi中阐明了决定蛹皮色素沉着和结构特征的全部分子途径。我们发现温度精确调控了ApADC的表达水平，从而调控了β-丙氨酰多巴的生物合成，进而决定了蛹皮的色素沉着模式、形态特征和层次结构。这些发现不仅揭示了驱动……

CRediT作者贡献声明

王勇：撰写 – 审稿与编辑，资金获取，概念构思。江雪莹：数据可视化，资源准备。秦莉：监督，资源管理，项目协调。刘伟：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目协调。王琪：撰写 – 初稿撰写，实验设计，数据分析。江云敏：数据可视化，结果验证，软件应用。唐静文：结果验证，数据分析，数据管理。

未引用的参考文献

Britton和Davidowitz，2023；Clark，2015；Clusella-Trullas和Nielsen，2020；Jacobs，1974；Kohn和Wittkopp，2007；Liu等人，2016；Liu等人，2015；Matsuoka和Monteiro，2018；Pérez等人，2018；Sobala和Adler，2016；Tan等人，2021；van't Hof和Saccheri，2010；Wittkopp和Beldade，2009；Zhang等人，2017；Zhang和Reed，2016。

数据可用性

数据可应要求提供。

资助

本研究得到了辽宁省教育厅青年科学研究基金 [编号JYTQN2024008]和中国农业研究系统专项基金 [编号CARS-18]的支持。