综述：基于单细胞RNA测序的机器学习方法在生物标志物发现中的应用

《Frontiers in Bioinformatics》：Machine learning approaches for biomarker discovery using single-cell RNA sequencing

这篇前沿综述系统梳理了机器学习与单细胞RNA测序（scRNA-seq）联用进行生物标志物发现的完整路线图。文章对比了传统差异表达分析（DGE）的局限，详解了细胞水平与患者水平两大类方法框架，并深入剖析了多种监督学习算法（如随机森林、XGBoost、支持向量机等）、特征选择策略（过滤法、包装法、嵌入法等）及其评估指标。最后，探讨了如何通过分类性能评估和下游生物学分析（如富集分析、生存分析）验证标志物的预测效能与生物学意义，为研究者提供了该领域的全景视野与方法学指南。

　　

在精准医疗时代，生物标志物（Biomarker）的发现对于疾病的诊断、预后和个性化治疗至关重要。传统的生物标志物发现主要依赖于批量RNA测序（bulk RNA-seq）和差异基因表达（Differential Gene Expression, DGE）分析。然而，bulk RNA-seq测得的是细胞群体的平均基因表达，掩盖了细胞间的异质性。而DGE分析通常采用单变量检验，忽略了基因间的相互作用，且对数据分布有特定假设，在样本量有限时可能失效。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的出现改变了这一局面。它能够在单个细胞分辨率下测量基因表达，使得研究人员能够识别稀有细胞群、解析细胞状态并推断谱系关系。这为生物标志物发现开辟了三个新维度：更广泛的输入表征（如单细胞表达谱、细胞类型特异性特征、伪批量（pseudo-bulk）谱、细胞类型比例等）、更灵活的分析层面（细胞水平与患者水平），以及更丰富的标志物输出类型（如疾病相关细胞类型、细胞类型特异性基因特征、细胞状态标志物等）。

尽管scRNA-seq带来了前所未有的分辨率，但当前生物标志物开发仍受限于统计效能低和结果可重复性差。为了克服传统DGE分析的局限性，利用机器学习（Machine Learning）进行生物标志物发现的方法日益受到青睐。与DGE不同，机器学习采用多变量策略，能够考虑基因间的潜在相互作用，识别出单独不显著但组合起来至关重要的基因。同时，机器学习算法灵活性高，对统计假设要求较低，还能有效捕捉基因间的非线性关系。

scRNA-seq与机器学习用于生物标志物发现的通用流程

一个典型的基于机器学习的scRNA-seq生物标志物发现工作流通常遵循几个核心步骤。首先，对原始的scRNA-seq数据进行标准预处理，包括质量控制、标准化、批次校正、聚类和细胞类型注释。预处理完成后，数据集被划分为训练集和测试集。随后，仅在训练集上进行特征选择（Feature Selection），以识别能够预测特定疾病或状况的基因，从而将全部基因集缩减为一小部分潜在的生物标志物候选基因。

理想的候选标志物应同时具备强大的预测性能和与目标疾病相关的生物学意义。因此，需要进一步评估。首先评估其预测能力：使用特征选择出的基因构建分类模型，先在训练集上训练，再在测试集上评估。一些工作流还会引入第三个独立的验证集，用于超参数调优和交叉验证，以提高模型的泛化能力并降低过拟合风险。分类性能通过各种分类指标（如准确率、精确率、召回率、F1分数、马修斯相关系数、受试者工作特征曲线下面积等）和特征重要性分数来评估。

其次评估其生物学相关性：潜在的生物标志物还需进行一系列下游生物学分析，包括检查它们与患者生存结局的关联、在疾病相关通路和生物过程中的参与情况、它们的差异表达模式，以及现有文献中支持其与目标疾病相关性的证据。

细胞水平与患者水平方法

基于机器学习的scRNA-seq生物标志物发现方法，可根据其应用的“水平”进行区分，主要分为细胞水平方法和患者水平方法。

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  细胞水平方法：这类方法侧重于利用单个细胞（而非患者）来识别预测性基因。通过将特征选择和监督学习应用于细胞水平的基因表达数据，这些方法旨在根据疾病或状况对细胞进行分类，从而在细胞群体内部和之间识别生物标志物。由于细胞数量远多于患者数量，细胞水平方法可以克服数据集大小的限制，通过增加机器学习模型可以训练的实例数量，最大化提高分类性能和发现更稳健生物标志物的可能性。细胞水平方法又可细分为：
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    通用细胞方法：假设所有细胞类型在特征选择和分类中被平等对待，只关注细胞的疾病状况标签，旨在识别能够区分不同疾病组、跨越不同细胞类型群体的生物标志物。
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    细胞类型特异性方法：旨在通过特征选择和在特定细胞类型群体内应用监督学习分类来识别潜在的生物标志物。其主要动机是利用scRNA-seq探索细胞异质性的能力，促进细胞类型特异性生物标志物的发现，这是通用细胞方法无法实现的。
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  患者水平方法：这类方法以个体患者为发现的主要对象，目标是利用特征选择和监督学习来识别能够用于模型将个体患者分类到相应疾病组的高度预测性基因。由于scRNA-seq捕获的是细胞水平的基因表达，患者水平方法通常需要一个额外的预处理步骤，以从细胞水平基因表达数据中实现患者预测。常见策略包括：
  1. 1.
     将细胞水平基因表达转化为患者水平基因表达，例如通过生成伪批量基因表达（聚合每个患者所有细胞中每个基因的平均表达值）。
  2. 2.
     聚合细胞水平分类模型的预测概率。
  3. 3.
     使用每个患者中细胞类型的比例作为特征。

监督学习算法与特征选择方法

当前应用于scRNA-seq生物标志物发现的监督学习算法多种多样，不同算法评估和排序特征以进行分类的方式不同。因此，所选的潜在生物标志物会因所采用的算法而有很大差异。常用的算法包括：

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  决策树：通过树状结构建模决策，内部节点代表特征（基因），叶节点代表预测结果（疾病状况）。
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  随机森林：集成多个决策树，通过聚合各树的预测来提高准确性和鲁棒性。
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  提升算法：如XGBoost、AdaBoost，以序列方式构建树，每棵新树纠正前一棵树的错误。
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  逻辑回归：使用逻辑函数基于输入预测某种结果的概率。
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  支持向量机：寻找最优超平面以分离不同类别的数据点。
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  朴素贝叶斯：基于贝叶斯定理，假设特征在给定类标签条件下相互独立。
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  神经网络算法：如前馈神经网络，能够从大量数据中学习复杂模式。

特征选择是机器学习中用于从数据集中识别最相关特征的过程，旨在提高模型性能、减少过拟合并帮助解释。在生物标志物发现的背景下，特征选择用于选择对预测不同疾病或结果组高度相关的基因。特征选择方法主要分为五类：

1. 1.
   过滤法：在分类模型之前且独立于模型识别重要特征，通常基于传统的统计检验和指标进行排序。例如mRMR算法、互信息、方差分析等。
2. 2.
   包装法：根据机器学习模型的性能来识别潜在的生物标志物。它将生物标志物发现过程视为一个迭代搜索问题，评估不同基因组合的分类性能，并选择性能最佳的基因集作为潜在的生物标志物。例如递归特征消除、Boruta算法、增量特征选择等。
3. 3.
   嵌入法：将生物标志物识别过程直接集成到机器学习模型训练中。它通过调整每个基因的重要性分数来优化分类性能，识别出能最大化准确性的最优函数权重，并选择对模型预测贡献最大或最显著的基因作为潜在的生物标志物。例如LASSO算法，或基于树状算法的特征重要性评分。
4. 4.
   混合法：将多种特征选择方法整合到一个多步骤过程中，通常以过滤法开始，然后是包装法或嵌入法，以兼顾效率和性能。
5. 5.
   集成法：采用并行共识方法，结合两种或更多不同的特征选择方法。首先分别通过不同的特征选择方法识别特征子集，然后应用共识投票框架来识别被多种独立方法共同选中的重叠特征，以评估生物标志物的稳健性和稳定性。

潜在生物标志物的分类与下游生物学评估

对通过特征选择筛选出的基因，需要进一步进行全面的评估，以确保其作为潜在生物标志物的可靠性和实用性。评估主要围绕两个方面：预测有效性和生物学相关性。

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  通过分类性能评估：通常使用分类指标和特征重要性分数两种度量类型。
  • •
    分类指标：评估所选生物标志物在新数据（测试集）中预测不同疾病状况的有效性。这些指标基于分类的四种可能结果：真阳性、真阴性、假阳性、假阴性。常用指标包括准确率、精确率、召回率、F1分数、马修斯相关系数、受试者工作特征曲线下面积等。
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    特征重要性分数：量化每个特征对模型决策过程和预测的贡献程度，有助于确定哪些特征对准确分类最具影响力。分为模型特异性分数（如树状模型的基尼重要性、逻辑回归的系数大小、支持向量机的权重）和模型无关分数（如SHAP值）。SHAP值基于合作博弈论，可以一致地应用于不同的分类器，便于跨模型比较特征重要性。

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  通过下游分析评估：在评估了所选基因的分类性能后，必须进一步评估它们与目标疾病的总体相关性，然后才能将其视为潜在的生物标志物。下游生物学分析是验证潜在生物标志物是否与目标疾病或病症相关且具有关联性的关键。
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    生物学相关性验证：
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      富集分析：用于评估机器学习筛选出的生物标志物是否与特定疾病内已知的生物学过程、功能或通路显著相关。通常使用基因集富集分析或过度表征分析，应用于基因本体、京都基因与基因组百科全书或分子特征数据库等数据库。
    • •
      生存分析：用于通过确定所选基因与时间事件结局（如总生存期、无病生存期、无进展生存期）的关联来评估其临床相关性。常用技术包括Kaplan-Meier估计量和Cox比例风险模型。
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    通过差异基因表达分析验证：稳健的生物标志物的一个标志是它们在不同特征选择方法中能被一致地识别。通常将DGE分析作为二次验证步骤，为机器学习选择的基因提供额外的证据支持，并与传统的非机器学习研究报告的基因进行比较，从而在更广泛的现有生物学研究背景下增强所选生物标志物的可解释性和可信度。

讨论与展望

尽管机器学习在生物标志物发现中的应用有望比传统统计方法带来显著改进，但在其广泛应用之前，仍有许多挑战需要解决。当前阻碍机器学习用于scRNA-seq生物标志物发现的一个主要限制是可比性。由于该领域仍处于发展阶段，不同的研究中使用了各种各样的策略、算法和评估指标。不同的机器学习算法、特征选择方法和分析“水平”的多样性使得直接比较结果、重复实验和建立共识基准变得困难。

此外，机器学习在scRNA-seq生物标志物发现中的应用目前还受到可及性问题的阻碍。要充分运用机器学习，需要具备计算机科学和编程的基础知识，这对许多研究人员来说是一个障碍。虽然传统统计方法的使用也存在技术上的挑战，但像DESeq2和edgeR这样的解决方案提供了用户友好的软件包，为没有广泛编程专业知识的研究人员提供了可用的工具。相比之下，当前用于scRNA-seq生物标志物发现的机器学习技术通常仅限于论文特定的伪代码或需要专门知识才能实现的GitHub仓库，从而限制了它们在生物标志物发现中的广泛应用。

为了使机器学习在scRNA-seq生物标志物发现中得到更广泛的采用，未来的研究应侧重于通过基准测试和稳健的统计评估来建立方法学的共识标准，以提高可比性和可重复性。同时，也应努力通过开发标准化的、用户友好的工具来提高可及性，降低没有广泛计算专业知识的研究人员的使用门槛。