首次在波斯尼亚和黑塞哥维那的牛群中检测到嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）以及东方泰勒虫（Theileria orientalis）的流行病灶

《Frontiers in Veterinary Science》：First detection of Anaplasma phagocytophilum and enzootic focus of Theileria orientalis in cattle from Bosnia and Herzegovina

　　摘要
东方泰勒虫（Theileria orientalis）是一种通过蜱虫传播的红细胞内寄生虫，可引起牛的东方泰勒虫病（oriental theileriosis）。该寄生虫在全球范围内都有分布，不属于人畜共患病原体，但其临床症状从亚临床到严重不等。泰勒虫属（Theileria spp.）常与其他蜱传病原体（如巴贝斯虫属Babesia spp.、无形体属Anaplasma spp.，包括具有日益重要性的嗜吞噬细胞无形体Anaplasma phagocytophilum）共同感染牛。本研究旨在探索黑塞哥维那Gacko和Bile?a地区牛群中无形体属及其他血液寄生虫的感染情况。根据兽医报告的蜱虫感染情况，选取了35头临床健康的牛作为样本，并通过显微镜检查、PCR（检测巴贝斯虫/泰勒虫；无形体科Anaplasmataceae）和qPCR（检测A. phagocytophilum、A. platys、A. marginale）方法进行了分析。显微镜检查发现多个样本中存在红细胞内的细菌形态。其中1个样本检测出A. phagocytophilum DNA，34个样本检测出巴贝斯虫/泰勒虫DNA。通过16S rRNA基因测序，该A. phagocytophilum分离株被归类为欧洲谱系，表明该病原体主要在野生动物与硬蜱Ixodes ricinus之间的循环中传播。18S rRNA基因测序显示T. orientalis分离株存在一定的区域聚集性。这是首次在黑塞哥维那东部牛群中分子水平确认A. phagocytophilum的存在，并发现了可能的T. orientalis地方性感染焦点，提示需要进一步研究该地区的蜱虫媒介和宿主动物。

1 引言
嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）是一种全球分布的、新兴的蜱传革兰氏阴性细胞内细菌，属于无形体属（Anaplasma），其他相关物种还包括A. platys、A. centrale、A. bovis、A. marginale、A. ovis和A. capra。这种细菌可感染家畜和人类，尤其在免疫功能低下者中引发严重疾病（1-3）。该细菌的地理分布与其主要媒介硬蜱Ixodes ricinus密切相关，流行病学研究表明其在大多数欧洲国家均有存在（3）。A. phagocytophilum的宿主包括大型野生动物（如鹿、狍子和麋鹿）和啮齿动物（如老鼠、鼩鼱和田鼠）。该细菌可导致反刍动物出现蜱传热病（又称牧场热），临床症状严重程度不一，从羔羊的严重症状到牛的轻微或亚临床症状都有（4）。此外，它还引起马的粒细胞无形体病（EGA）和狗的粒细胞无形体病（CGA）。A. phagocytophilum是一种人畜共患病原体，可导致人类粒细胞无形体病（HGA），表现为类似流感的症状，如发热、寒战、头痛和白细胞减少，可能引发严重并发症（2, 5）。HGA常见于莱姆病流行地区，在北美、欧洲和亚洲已有报道，且常与其他病原体共感染（6）。

目前关于波斯尼亚和黑塞哥维那家畜中无形体属的分布数据尚不充分，而该地区蜱虫媒介及其他蜱传病原体（如莱姆病伯氏疏螺旋体）的分布数据较为详尽。在波斯尼亚和黑塞哥维那的蜱虫和狗体内已检测到A. phagocytophilum（7, 8, 9），但据我们所知，尚未有关于家养反刍动物中A. phagocytophilum感染的数据。黑塞哥维那地区的绵羊中检测到显著的A. ovis遗传多样性（10），这表明根据当地兽医、动物主人和流行病学服务的观察结果，该地区可能存在其他无形体属物种。多项研究表明，A. phagocytophilum在巴尔干地区的动物和蜱虫中存在传播（11）。在塞尔维亚的一项研究中，Vasi?等人发现牛群中A. phagocytophilum的血清阳性率为2.45%（4/163；95% CI: 0.96%?6.14%），且血清阳性动物的血液中未检测到细菌DNA（11）。野生食肉动物被认为是多种人畜共患病原体的宿主和潜在传播者（12）。另一项塞尔维亚的研究在金豺（Canis aureus）的脾脏样本中检测到0.9%（2/216；95% CI: 0.26%?3.31%）的A. phagocytophilum DNA（13），表明野生食肉动物在自然界的传播循环中起作用。此外，在塞尔维亚靠近波斯尼亚和黑塞哥维那边境的地区也检测到蜱虫中的A. phagocytophilum（14）。在克罗地亚，A. phagocytophilum在动物宿主和蜱虫中被发现，并有HGA病例报告（15, 16）。

东方泰勒虫病是由东方泰勒虫复合体（Theileria orientalis/buffeli/sergenti）引起的原生动物疾病（17, 18）。根据不同泰勒虫种类，Amblyomma、Haemaphysalis、Hyalomma和Rhipicephalus属的硬蜱均可传播这些病原体（19）。由T. orientalis复合体引起的泰勒虫病原本被认为是良性的且无症状的，但澳大利亚、日本和新西兰也有临床病例报告（20-22）。目前，11种T. orientalis基因型中只有Ikeda和Chitose被认为具有致病性（18）。感染高剂量Ikeda基因型的牛常出现贫血，临床症状包括呼吸急促、嗜睡、共济失调、妊娠动物流产，死亡率可达10%。应激因素（如分娩、哺乳和运输感染动物）会加重病情。过去二十年里，由于其主要媒介硬蜱Haemaphysalis longicornis的广泛分布，T. orientalis Ikeda的地理分布范围显著扩大（23, 24）。此前在波斯尼亚和黑塞哥维那的萨拉热窝-罗曼尼亚地区记录到高发的T. orientalis（25）。欧洲的研究也表明该病原体存在于意大利（26）、希腊（27）、西班牙（28）、葡萄牙（29）、罗马尼亚（30）、匈牙利（17）、英国（31）、塞尔维亚（11）、克罗地亚（32）和俄罗斯（33）。多项研究表明T. orientalis常与A. marginale（32, 34, 35）或巴贝斯虫属（35-37）共感染。一些研究认为，由于“干扰现象”，牛单感染T. orientalis或血孢子虫的情况比共感染更为常见（38）。

基于在黑塞哥维那东部检测到A. ovis以及萨拉热窝-罗曼尼亚地区牛群中牛巴贝斯虫病的高发情况，本研究旨在根据欧洲的流行病学数据确定该地区牛群中无形体属（特别是A. phagocytophilum、A. platys和A. marginale）和巴贝斯虫/泰勒虫的存在情况。此外，本研究还首次使用A. phagocytophilum的多态性ankA基因位点对其进行了分子鉴定（39）。ankA基因测序已成为A. phagocytophilum系统分类的关键工具，因其高度遗传变异性能够区分无法通过16S rRNA等保守标记区分的生态型和宿主相关谱系（40）。本研究旨在为进一步监测家畜中的无形体属及其对动物健康和疾病传播的影响奠定基础，同时探讨牛巴贝斯虫的流行病学和临床意义。

2 材料与方法
2.1 采样与研究区域
2024年6月初，兽医从Gacko市（坐标43.1667, 18.5333）（n = 30）和Bile?a市（坐标42.8765, 18.4297）（n = 5）收集了35份临床健康的牛血样。这些地区属于黑塞哥维那东部，地形以丘陵为主，具有地中海气候和大陆性-山地气候的交汇特征。采样在Gacko市的四个地点以及Bile?a市的一个地点进行（图1）。

图1 Gacko和Bile?a研究区域的地理地图——红色圆圈表示A. phagocytophilum感染阳性地点。

研究对象的选取基于牛主人和当地兽医的报告，这些报告指出2月至5月期间牛身上有大量蜱虫，目的是更好地了解该地区蜱虫可能传播的病原体种类多样性。本研究遵循塞尔维亚共和国的《动物保护与福利法》（“塞尔维亚共和国官方公报111/08”）进行。由于样本是在当地兽医的正式检查过程中采集的，因此无需伦理声明。

采血前收集了家庭地理位置、动物品种、性别、年龄等重要信息，以及可能的健康状况变化情况。所有参与研究的35头牛均为雌性，年龄在2至16岁之间。采样时未在这些牛身上发现蜱虫。血液样本通过刺破尾静脉收集到EDTA试管中，制成薄玻璃片涂片，并在当天冷链运输至塞尔维亚共和国巴尼亚卢卡的“Dr. Vaso Butozan”兽医研究所，储存在-20°C条件下直至DNA提取。

2.2 显微镜检查
所有收集的血液样本均制成薄玻璃片涂片，晾干后用甲醇固定，用Giemsa染色，并在光学显微镜下观察（放大40倍以观察整个涂片表面，放大100倍以描述观察到的结构形态）。详细描述了观察到的结构形状（如圆形、梨形、椭圆形），以及其在血细胞内的数量和排列方式（周边、次中心、中心）。

2.3 DNA提取
从200 μL EDTA血液中提取总DNA，主要使用IndiSpin Pathogen Kit（Indical Bioscience，莱比锡，德国）按照制造商说明进行。提取的DNA样本经过适当标记和包装后，送往塞尔维亚共和国巴尼亚卢卡的“Dr Vaso Butozan”兽医研究所的病毒学和分子诊断实验室，储存在-20°C条件下直至进一步分析。

2.4 分子病原体检测
使用Torina等人描述的特异性PCR协议（针对msp4基因，344 bp）（41），通过常规PCR方法检测A. marginale基因组的存在。反应使用Himedia Hi—Chrom PCR Master mix（HigenoMB，印度）和Nexus PCR Thermal cycler（Eppendorf，汉堡，德国）进行。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶（100 V，60 min）上进行电泳，预染色后用Midori green显色并在紫外光下观察。

部分提取物（30 μl）被冷链运输至塞尔维亚兽医科学研究所，储存在-20°C条件下直至进一步使用。首先，根据Parola等人的方法（42），针对16S rRNA基因中的345 bp片段进行检测。使用先前描述的引物（43）通过PCR检测巴贝斯虫/泰勒虫DNA。反应使用PCR Master Mix 2x（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）和MJ Mini Personal Thermal Cycler（Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯）进行，随后在琼脂糖凝胶上进行电泳并用Simply Safe?（EURX，格但斯克，波兰）显色。电泳过程中使用6x Orange DNA Loading Dye（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）监测DNA迁移情况。

使用表1中列出的引物和探针检测A. platys和A. phagocytophilum的特异性DNA。A. platys的分子靶标为groEL基因，A. phagocytophilum的靶标为msp2基因（44）。反应使用Fast Gene Probe 2x qPCR Universal Mix（Nippon Genetics Europe，杜伦，德国）（引物10 μM，探针5 μM）在MIC（Magnetic Induction Cycler，澳大利亚布里斯班）上进行。鉴定为A. phagocytophilum的样本进一步使用ankA基因特异性引物进行检测并准备测序（45）。每次PCR实验都包含了实验室自备的足够数量的阳性和阴性对照样本，引物组合列在表1中。

表1 病原体 引物名称 序列（55′-33′） 参考文献
巴贝斯虫/泰勒虫 BJ BN2-GTCTTGTAATTGGAATGATGG- -AGTTTATGGTTAGGACTACG-(42)
无形体科 EHR 16SD EHR 16SR-GGTACCYACAGAAGAAGTCC- -TAGCACTCATCGTTTACAGC-(41)
边缘无形体 AmargMSP4Fw AmargMSP4Rev-CTGAAGGGGGAGTAATGGG- -GGTAATAGCTGCCAGAGATTCC-(40)
扁平无形体 An_pla_groEL_F An_pla_groEL_R An_pla_groEL_P-GCTATGGAAGGCAGTGTTGG- -GTCTTGAAGCGCTCGTAACC- -AATCTCAAGCTCAACCCTGGCACCAC-(43)
嗜吞噬细胞无形体 An_ph_msp2_F An_ph_msp2_R An_ph_msp2_P-GCTATGGAAGGCAGTGTTGG- -GTCTTGAAGCGCTCGTAACC- -AATCTCAAGCTCAACCCTGGCACCAC-(43)
嗜吞噬细胞无形体 AnkaAP2074s AnkaAP2815a-GGCAAATGAGGCAAGTAACC- -GCCACTACCCAAGGATGATAG-(44)

2.5 系统发育分析
从凝胶中切下无形体科和巴贝斯虫/泰勒虫的阳性PCR产物，使用Agarose-out DNA纯化试剂盒（EURx，格但斯克，波兰）进行纯化，并用PCR引物进行双向测序。使用MEGA 12软件（46）生成共识序列，并进一步通过BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）进行分析。成对距离使用MEGA 12软件计算。嗜吞噬细胞无形体的进化历史通过最大似然法推断，进化距离使用Kimura 2参数方法和1000次重复的自助法计算得出。总共使用了来自GenBank的21个无形体物种的核苷酸序列进行系统发育分析（14株嗜吞噬细胞无形体，2株边缘无形体，3株扁平无形体和2株牛无形体），同时将立克次体ricketsii作为外群。获得的序列被存入GenBank，登录号为PV056069。
同一样本随后使用特定的PCR引物分析了ankA基因。在MEGA 12中使用通用时间可逆替换模型重建了最大似然系统发育树。速率异质性用离散的Gamma分布（五个类别，+G参数=2.9617）和不变位点的比例（+I=0.00%）进行建模。包括第1、2、3位密码子位置和非编码位点，使用完全删除选项消除了含有间隙或缺失数据的位点，最终得到494个位点的比对结果。91个嗜吞噬细胞无形体的编码核苷酸序列根据Rar等人（39）的方法被分为12个簇。所得到的ankA序列被存入GenBank（登录号PX255552）。
东方泰勒虫的系统发育树使用最大似然法和Tamura（1992）的核苷酸替换模型推断（47）。分析过程包括最终数据集中的35个核苷酸序列和436个位点，还包括来自GenBank的类似东方泰勒虫的核苷酸序列以及牛巴贝斯虫序列作为外群（48）。获得的序列被存入GenBank，登录号为PV581906-PV581910。

3 结果
3.1 显微观察
对35个血液样本的显微镜检查显示，31个样本中存在细胞内和细胞外的细菌。这些细菌主要位于红细胞中，通常位于细胞边缘，形态从球形到球杆菌形不等（图2）。无法区分无形体和支原体属内的不同物种。在白细胞或血小板中未检测到细菌结构。鉴于此，采用分子生物学方法进行了鉴别诊断。在20个样本中检测到了梨形虫。由于裂殖子和红细胞内结构的形态学特征，难以准确鉴定物种水平。然而，图3展示了东方泰勒虫的典型形态。

图2 红细胞中的球形和球杆菌形细菌（1,000倍）（“Dr. Vaso Butozan”，2024年）。
图3 红细胞中的典型东方泰勒虫形态（1,000倍）（“Dr. Vaso Butozan”，2024年）。

3.2 嗜吞噬细胞无形体的分子检测结果
来自Gacko地区的1个样本（图1）通过qPCR检测出嗜吞噬细胞无形体的存在（Ct = 23.23）。这头健康的奶牛在采样时没有表现出疾病症状，年龄为8岁。

3.3 嗜吞噬细胞无形体序列的系统发育分析
通过将21个无形体物种的序列与本研究获得的序列进行比对，确认其属于嗜吞噬细胞无形体组（图4），与加纳OR241137.1（100%）、巴西KP642755.1（100%）和丹麦253AJ776165.1（99%）的菌株具有最高相似性。对部分ankA基因的最大似然分析将我们的牛分离株（PX255552）归入Rar等人（39）定义的第一组，与欧洲反刍动物分离株（例如中欧和北欧的野牛/牛）聚类在一起，不同于人畜共患病组I亚群（图5中标记为“Z”）。波斯尼亚的序列与邻近的欧洲反刍动物菌株形成了一个支持良好的分支，表明其属于与反刍动物相关的谱系，而非人畜共患病谱系。这一ankA序列的定位补充了16S rRNA的结果，并细化了检测到的嗜吞噬细胞无形的分子特征，与我们研究中使用的12簇ankA方案一致。

图4 基于部分16S rRNA基因的核苷酸序列的最大似然系统发育树。立克次体ricketsii被作为外群。数字代表支持节点的1000次自助迭代的百分比，仅显示大于50%的百分比。本研究中的嗜吞噬细胞无形体核苷酸序列用黑色圆圈标记。每个序列的GenBank登录号、分离株名称和来源国家均已标明。

图5 基于部分ankA基因的核苷酸序列的最大似然系统发育树。数字代表支持节点的1000次自助迭代的百分比，仅显示大于50%的百分比。本研究中的嗜吞噬细胞无形体核苷酸序列用黑色三角形标记。每个序列的GenBank登录号、分离株名称和来源国家均已标明。序列根据Rar等人（39）的分类进行分组。人畜共患病菌株用“Z”标记。

3.4 巴贝斯虫/泰勒虫的分子检测结果
在34个样本中检测到巴贝斯虫/泰勒虫物种的DNA片段（Gacko地区29个，Bile?a地区5个）。高质量的扩增子（n = 5）被用于测序和系统发育分析。

3.5 东方泰勒虫序列的系统发育分析
基于部分18S rRNA基因序列的东方泰勒虫系统发育树显示遗传变异有限，这与核糖体RNA基因的高度保守性一致（图6）。尽管如此，区域聚类仍然明显，特别是在波斯尼亚分离株（PV581906–PV581909和ON148460–ON148462）中，它们形成了一个独特的单系群。来自世界其他地区的相关序列进一步证实了东方泰勒虫在全球范围内分布且遗传稳定的观点。虽然18S rRNA基因对于种内变异的分辨率有限，但树状图反映了微妙的地理结构。PV581910属于一个覆盖波斯尼亚东南部和克罗地亚的区域性东方泰勒虫群体，序列差异很小，这与保守的18S基因一致，表明该地区的传播周期稳定。本研究中的波斯尼亚分离株之间的核苷酸序列一致性在99.3%到100%之间（成对距离最多0.7%），而与其他先前报道的波斯尼亚和黑塞哥维那的序列相比，相似性在99.1%到100%之间（成对距离最多0.9%）。与其他国家的序列相比，相似性在98.8%到100%之间（成对距离最多1.1%）。

图6 基于部分18S rRNA基因的东方泰勒虫核苷酸序列的最大似然系统发育树。牛巴贝斯虫被作为外群。数字代表支持节点的1000次自助迭代的百分比，仅显示大于50%的百分比。本研究中的东方泰勒虫核苷酸序列用黑色方块标记。每个序列的GenBank登录号、分离株名称和来源国家均已标明。

4 讨论
东方泰勒虫是一种原生动物寄生虫，在大多数情况下会引起非特异性症状，因此难以确定其临床意义。这些梨形虫通常在感染后不会从循环中消失，感染动物的寄生虫血症会持续很长时间，如果形成携带状态，则可能终生存在（18）。我们的研究证实，在东黑塞哥维纳地区的放牧健康牛群中存在大量PCR阳性的梨形虫病例。克罗地亚的一个病例研究表明，东方泰勒虫与边缘无形体和牛巴贝斯虫的共感染导致了三头牛的致命后果（32）。与我们的发现相反，在邻近的塞尔维亚记录的无症状牛群中，东方泰勒虫的检出率非常低（5/135，3.70%）（11）。它在意大利、西班牙、葡萄牙、希腊和巴尔干地区等一些欧洲国家的检出率逐渐增加（25–28）。由于气候变化和动物流动，其流行率在不同地区有所差异。尽管本研究未对检测到的菌株进行基因分型，但分子证据证实了该地区东方泰勒虫的活跃传播。在该国南部发现的流行病焦点表明，稳定的传播周期可能受到有利环境条件和有效蜱虫媒介（如Haemaphysalis spp.和Rhipicephalus spp.）的支持。这些地区高比例的无症状感染牛可能表明东方泰勒虫的地方性稳定，或者表明存在的东方泰勒虫基因型的致病性相对较低（17, 25）。本研究仅限于黑塞哥维纳地区的选定农场，可能无法完全反映流行病焦点的空间范围，缺乏直接的蜱虫收集和鉴定限制了我们确认当地传播媒介的能力。动物流动、牧场共享和蜱虫控制措施等因素也影响了我们对流行病建立风险因素的评估。
本研究还记录了在牛血样本中检测到嗜吞噬细胞无形体特异性DNA，这是首次在东黑塞哥维纳（Romanija地区）的牛群中检测到该病原体。这些结果与先前关于蜱虫（7）和狗（8, 9）中嗜吞噬细胞无形体存在的报道一致，并扩展了对其在不同宿主体内地理分布的现有知识，同时也证实了其持续传播。获得的核苷酸序列与奥地利、波兰、丹麦和土耳其的序列聚类，表明这些地区可能存在潜在的流行病学联系和病原体传播。16S rRNA序列的观察到的聚类表明，嗜吞噬细胞无形体谱系在欧洲稳定传播，可能通过野生动物库和蜱虫迁移维持。在野生和家养反刍动物（尤其是绵羊和山羊）中检测到嗜吞噬细胞无形体，不同地区的报告结果各不相同（4, 50–52）。波兰的一项最近研究指出这些动物可能是潜在的宿主（53）。有趣的是，另一项波兰研究（54）在森林地区的自由放养山羊中未发现嗜吞噬细胞无形体的证据，这表明与其他反刍动物相比，这种物种的感染率较低，与Rubel等人（55）的德国研究结果一致。德国的数据表明该病原体在奶牛中的流行率较高，可能由野生动物库维持（4）。此外，在土耳其，Aktas等人（56）在小反刍动物中检测到嗜吞噬细胞无形体，尽管检测到一种遗传上不同的变体（类似嗜吞噬细胞无形体1），这表明这些地区存在适应性基因变异，需要进一步研究。与我们的研究类似，英国的一项研究也使用msp2基因作为嗜吞噬细胞无形体检测的目标，证实了其在牛、羊和刺猬蜱中的存在，并提出了牛在该病原体流行病学循环中的潜在作用（57）。
基于ankA的系统发育分析进一步细化了我们菌株的分子特征。Rar等人（39）表明，ankA多样性将嗜吞噬细胞无形体分为12个与宿主/媒介相关的簇，与MLST和groEL生态型一致。本研究中的样本属于ankA簇I。然而，它位于人畜共患病亚群之外，与在中欧和北欧传播的反刍动物相关谱系的报道相符（4, 51）。在波兰，鹿类是主要的宿主，携带多种groEL基因型，最近的 Roe/红鹿分型显示ankA/groEL组合包括I组变体以及适应鹿类的谱系（53, 58）。野生猪也在波兰携带了人类致病性变体，强调了更广泛的野生动物库（59）。英国的生态型分析进一步表明，牛感染通常与groEL Ecotype I一致，而土耳其记录的牛病例未进行ankA分型（57, 60）。总体而言，这些数据支持我们的解释，即波斯尼亚分离株属于主要在野生动物-刺猬蜱循环中的反刍动物相关ankA组I谱系。牛巴贝斯虫的诊断通常依赖于观察临床症状，随后通过Giemsa染色的薄血涂片检查来识别包涵体。在我们的研究中，球形和球杆菌形细菌主要位于红细胞边缘。然而，本研究中通过显微镜观察到的无形体（Anaplasma）和支原体（Mycoplasma）物种的存在需要进一步的证据支持。由于血液涂片中的颜色变化可能是由染色残留物、Howell-Jolly小体或Pappenheimer小体引起的，因此我们的研究未能确认在邻国克罗地亚有症状的牛中报告存在的A. marginale。此外，显微镜检查也未在白细胞或血小板中发现细菌结构。众所周知，A. phagocytophilum的DNA可以在通过血液涂片显微镜观察到可见包涵体之前的几天内被检测到，并且受感染的白细胞比例可能会有很大差异。本研究中使用的qPCR协议（msp2基因）具有高特异性和敏感性，因此在一个样本中检测到A. phagocytophilum的DNA是在qPCR方法的可接受范围内的。

本研究的局限性包括样本量较小（n = 35），这可能是仅检测到一个A. phagocytophilum阳性样本的原因。目前无法进行大规模研究以进一步了解这种蜱传病原体在牛群中的传播情况和临床意义。本研究是一项探索性调查，而非流行病学研究，样本选择基于兽医报告的蜱虫感染情况。因此，我们的结果不能推广到整个波斯尼亚和黑塞哥维那的牛群。研究的另一个局限性是缺乏关于媒介蜱虫的数据，由于研究重点在于动物健康，因此没有收集这些数据。

不同种类的无形体有不同的传播媒介：A. ovis和A. marginale主要通过Rhipicephalus和Dermacentor蜱虫传播，A. phagocytophilum通过Ixodes属蜱虫传播，而A. platys则通过R. sanguineus（棕色犬蜱）传播。在波斯尼亚和黑塞哥维那，已记录有11种硬蜱虫，其中I. ricinus最为常见，其次是D. marginatus、R. bursa、Hyalomma marginatum、R. sanguineus sensu lato、Haemaphysalis punctata、I. canisuga、D. reticulatus、I. hexagonus和H. concinna。Stevanovi?等人的研究证实，在东黑塞哥维那，R. bursa是寄生在羊身上的主要蜱虫种类。然而，本研究未能收集到寄生在牛身上的蜱虫，导致对蜱虫种类的组成存在不确定性，只能根据流行病学数据进行推断。此外，由于采样是基于流行病学数据的即时研究，因此没有考虑蜱传病原体引起的疾病的季节性发生情况。

与某些无形体物种不同，没有证据表明A. phagocytophilum会在Ixodes蜱虫中通过卵传播。因此，宿主动物对于维持其在环境中的地方性生命周期至关重要。Rubel等人报告称，养牛场中猫和狗的存在与养殖反刍动物暴露于无形体之间存在强烈相关性。然而，它们作为A. phagocytophilum的宿主的作用存在争议且可能性很低。在意大利野生反刍动物中检测到的高A. phagocytophilum流行率突显了它们作为该病原体感染循环中的重要性。此外，野生反刍动物不仅有助于I. ricinus蜱虫的发育和繁殖，还携带多种A. phagocytophilum基因变异体。尽管如此，目前关于东黑塞哥维那A. phagocytophilum宿主动物的信息仍然不足，其具体的传播媒介物种仍有待确定。

**结论**
本研究证实了黑塞哥维那存在东方泰勒虫（T. orientalis）的地方性感染证据，这种感染主要由亚临床感染驱动。这表明宿主、媒介和病原体之间的相互作用可能处于动态平衡状态。本研究中观察到的大量巴贝斯虫/泰勒虫阳性牛支持了东方泰勒虫病在波斯尼亚和黑塞哥维那广泛存在的观点。与PCR诊断方法相比，显微镜诊断在检测牛中的梨形虫方面存在局限性。此外，我们首次提供了黑塞哥维那牛体内A. phagocytophilum DNA的分子证据。ankA基因分析进一步表明，这种波斯尼亚分离株属于与反刍动物相关的I谱系，不同于人畜共患亚群，这强调了在评估病原体可能对牛和人类的传播风险时监测野生动物与I. ricinus循环的必要性。