《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A novel cultivation strategy to recover NK cell cytotoxicity
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为了解决批式培养NK-92细胞系时细胞毒性随乳酸积累而迅速丧失的制造难题，本研究开发并验证了一种将细胞增殖与功能恢复解耦的两阶段制造策略。通过实验设计与建模，确定了新鲜培养基比例和恢复时间是细胞毒性恢复的主要驱动因素。在优化的条件（90%新鲜培养基，37.2°C，恢复3.7天）下，成功恢复了细胞毒性并最大化了细胞毒能力。该策略随后在2L搅拌式生物反应器中成功验证，实现了大规模扩增（2.0 × 109细胞）和细胞毒性恢复（43% ± 8%）。这种可扩展的范式最小化了培养基使用，并规避了连续灌流，为提高NK-92效力和制造高质量先进疗法药品提供了潜在工作流程。
在癌症免疫疗法的星海中，嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）曾如璀璨新星，照亮了血液肿瘤的治疗前景。然而，其患者特异性制造流程复杂耗时、可能引发严重毒性反应以及在实体瘤中疗效有限等挑战，促使科学家们将目光投向了另一种“现货型”的免疫细胞——自然杀伤细胞。NK细胞凭借其强大的先天杀伤能力和较低的同种异体排斥风险，成为极具潜力的替代选择。其中，源自非霍奇金淋巴瘤患者的NK-92细胞系，因其均质性、高细胞毒性、易于大规模扩增和基因修饰等优点，在临床前和早期临床试验中展现出良好的安全性，被视为一个前景广阔的治疗平台。
然而，从实验室走向工业化生产并非坦途。一个核心的“制造悖论”摆在面前：为了达到临床所需的治疗剂量（通常每位患者需要≥109个细胞），必须对NK-92细胞进行快速、大规模的扩增。但不幸的是，传统的批式培养（在培养过程中不补充新鲜培养基）在促进细胞增殖的同时，往往伴随着营养耗竭和代谢废物（如乳酸）的积累，导致细胞毒性——这个决定治疗效果的最关键质量属性急剧下降。这就好比工厂为了赶工而让工人在恶劣环境下超负荷工作，最终产量上去了，但产品质量却一塌糊涂。如何能既收获海量的细胞“士兵”，又能确保他们出厂时依然保持着强大的“战斗力”？这是生物工艺工程师们亟待破解的难题。
以往的研究暗示，营养物质（如葡萄糖、谷氨酰胺）的耗竭、乳酸和氨等代谢产物的积累、pH值和溶解氧水平的变化，都可能是导致NK细胞功能下降的“元凶”。尤其是在富含乳酸、类似肿瘤微环境的培养条件下，免疫细胞功能常常受损。乳酸不仅会抑制细胞生长，最近研究还发现它可能通过一种称为蛋白质乳酸化的翻译后修饰来影响细胞功能。尽管有诸如补料分批、灌流等更复杂的培养模式可以缓解代谢压力，但它们需要更复杂的设备和更高的成本。目前，制造协议仍严重依赖于保守的收获时间窗或终点的细胞毒性检测，这可能导致错过最佳收获时机，增加批次失败的风险。因此，深刻理解细胞毒性动态变化的机制，并据此开发灵活的制造策略，对于确保未来治疗产品的一致性和效力至关重要。
本研究正是基于上述背景，提出了一个大胆的假设：如果将NK-92细胞的增殖阶段和功能恢复阶段分离开来，这种优化的扩增模式将赋予制造过程更大的灵活性，减少培养基消耗，并最终确保产品的效力。研究团队构想了一个“先扩增，后充电”的两阶段策略，旨在破解制造悖论。该研究成果最终发表在了《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》期刊上。
为了验证这一策略，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，他们进行了为期8天的动力学监测，系统量化了NK-92细胞在静态批式培养过程中细胞毒性、活细胞计数、活率及细胞外代谢物（如葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、氨）的动态变化，建立了功能下降的基线轨迹。其次，他们设计并执行了一个包含32次运行的全因子实验设计，系统地改变了恢复阶段的四个关键参数：新鲜培养基比例、培养温度、溶解氧和恢复持续时间。随后，利用偏最小二乘建模分析了这些因素对细胞毒性和“细胞毒能力”（一个新定义的关键性能指标，为细胞毒性与总活细胞数的乘积）的影响，识别出主要驱动因素并确定了最优工艺参数组合。最后，为了验证小规模实验结果的可放大性，研究团队在一个2升工作体积的搅拌式生物反应器中进行了放大实验。在此过程中，他们实施了基于乳酸浓度的反馈控制补料分批策略，以维持培养环境的稳定，并在扩增阶段结束后，将优化的恢复条件应用于部分细胞，评估了大规模培养下的细胞毒性恢复效果。
1. 扩增过程中细胞毒性的丧失
研究人员首先在静态T瓶中进行为期8天的批式培养，以观察NK-92细胞的自然生长和功能变化。结果清晰地描绘出一个令人担忧的趋势：细胞毒性在培养早期（第2天）达到峰值（43.7% ± 2.92%）后便迅速下降，到第8天时已微乎其微（1.23% ± 0.08%）。与此同时，细胞数量在持续增长，但关键的“细胞毒能力”指标也在达到峰值后急剧下降。代谢分析显示，营养物质的消耗与细胞生长同步，而乳酸则在培养后期大量积累。这些数据共同表明，在单纯的批式扩增过程中，无法维持细胞的高功能性，为后续引入专门的恢复阶段提供了直接依据。
2. 扩增后细胞毒性的恢复
基于批式培养中观察到的功能丧失，研究进入了核心的恢复阶段。在培养第7天后，研究人员启动了一个设计严谨的恢复实验。实验设计（DoE）的结果清晰地指出，培养基成分是影响细胞毒性和细胞毒能力恢复的最重要因素，其次是恢复时间，温度的影响较小，而氧气水平在本研究设置下未显示出显著影响。
时间进程分析进一步揭示，在新鲜培养基和混合培养基条件下，细胞毒性随着恢复时间逐渐增加，并在第3天达到峰值，随后开始下降。在恢复第3天，使用新鲜培养基的细胞达到了最高的细胞毒性（42% ± 3.3%），显著高于混合培养基（32.2% ± 3.8%）和完全使用旧培养基（5.1% ± 0.6%）的条件。有趣的是，虽然新鲜培养基组的单细胞毒性最高，但混合培养基组因其具有更高的细胞总数，在“细胞毒能力”上反而略胜一筹。这表明在实际生产中，需要根据目标（追求最高单细胞效力还是最大总体杀伤潜力）来权衡培养基的使用比例。
2.1 恢复期间的细胞生长与活率
分析表明，细胞毒性的恢复与细胞增殖基本脱钩。只有混合培养基条件下的细胞显示出轻微的增殖，而在新鲜和旧培养基中细胞数量基本保持不变甚至略有减少。这支持了“恢复阶段主要专注于功能恢复而非数量扩增”的核心思想。在恢复第3天，混合培养基和新鲜培养基组的细胞活率高于旧培养基组。
2.2 细胞表面标志物分析
为了探究功能恢复的潜在机制，研究人员在恢复第3天分析了与NK细胞功能相关的数十种表面标志物。结果显示，除了CD15s和CXCR3在新鲜/混合培养基中有轻微上调外，其他包括谱系标志物、激活受体、耗竭标志物以及归巢受体在内的绝大多数标志物，在不同培养基条件下表达均无显著差异。这表明，在本研究观察的时间点，细胞毒性的恢复可能并非由这些表面蛋白的表达水平发生根本性改变所驱动，而更可能与细胞的代谢状态或内部信号通路等更深层次的调控有关。
2.3 与代谢产物的关联
相关性分析为功能丧失和恢复的机制提供了重要线索。恢复第3天的细胞毒性与恢复起始时培养基中的乳酸浓度呈强负相关，与pH值呈强正相关。这强烈提示，乳酸积累及其导致的酸化环境是抑制细胞毒性恢复的关键因素。而葡萄糖、谷氨酰胺、氨等代谢物的初始浓度则与细胞毒性恢复无显著相关性。
2.4 最优恢复条件的预测
基于实验数据建立的偏最小二乘模型具有良好的预测能力。模型预测，在恢复时间3.7天、温度37.2°C、使用90%新鲜培养基的条件下，可以同时最大化细胞毒性和细胞毒能力。这为后续的放大验证提供了精确的“配方”。
3. 在搅拌式生物反应器中验证细胞毒性恢复
为了证明该策略的工业可行性和可放大性，研究进入了关键的生物反应器验证阶段。
3.1 控制pH和乳酸条件下的扩增动态
在2L搅拌罐生物反应器中进行的补料分批扩增，成功生产了2.02 × 109个细胞。细胞毒性在第4天达到峰值（56.4% ± 0.5%）后开始下降，尽管从第4天到第6天通过补料将乳酸浓度稳定控制在约12 mM，但细胞毒性仍然持续降低。这进一步证实了乳酸本身对NK-92细胞毒性的直接抑制作用，而非仅仅通过降低pH起作用。到扩增结束时，细胞毒性已无法检测。
3.2 STR中优化条件下的细胞毒性恢复
扩增结束后，研究人员在同一个生物反应器中立即启动了恢复阶段，应用了预测的最优条件。结果令人鼓舞：细胞毒性迅速恢复，在第2天达到峰值（43.1% ± 8.2%），虽然略低于扩增阶段的峰值，但已从近乎为零的水平成功恢复。细胞毒能力也在恢复阶段显著提升。与扩增阶段结束时相比，恢复后收获的细胞其“空间时间产率”显著更高，凸显了恢复阶段对于提升最终产品功能“产能”的巨大价值。
研究结论与讨论
本研究成功开发并验证了一种用于NK-92细胞制造的新型两阶段培养策略。该策略的核心创新在于将“细胞扩增”和“功能恢复”两个目标解耦，分别进行优化。首先，通过系统的实验设计（DoE）和建模，研究明确了新鲜培养基比例和恢复时间是驱动细胞毒性恢复的最关键工艺参数，并精准预测了最优组合。其次，研究在机制层面提供了重要见解，即乳酸积累是导致NK-92细胞毒性在扩增中丧失、在恢复中被抑制的关键负面因素，这一发现通过强负相关性以及在生物反应器中即使控制pH后乳酸仍伴随毒性下降的现象得到了双重验证。
更为重要的是，该策略在2升搅拌式生物反应器中的成功放大，证明了其工业应用的可行性和可扩展性。它能够在无需复杂连续灌流系统的情况下，以相对经济的培养基消耗，实现大规模细胞生产与高效力细胞产品的兼得。研究人员提出的“细胞毒能力”这一新指标，整合了细胞数量和质量，为评估和比较不同工艺的整体产出效能提供了更全面的量化工具。
总之，这项工作不仅为生产高细胞毒性的NK-92细胞产品提供了一条具体、可操作的工艺路径，其“先扩增后恢复”的范式也为其他免疫细胞治疗产品的制造优化提供了新的思路。它强调了在先进疗法制造中，将关键质量属性动态监控与智能工艺控制相结合的重要性，是推动“现货型”细胞疗法从实验室走向产业化、降低生产成本、并最终惠及更多患者的关键一步。
