福建沿海两种赤潮藻的快速检测方法与现场应用

《Frontiers in Marine Science》：Rapid detection methods and field applications for two types of red tide algae in Fujian coastal areas

　　

福建沿海水域由东海原甲藻（*Prorocentrum donghaiense*）和中肋骨条藻（*Skeletonema costatum*）主导的赤潮（Red Tides）事件发生频率和影响日益加剧，但现有的检测方法（显微镜检、分子生物学检测）存在劳动密集、耗时且依赖仪器设备等缺点，限制了其在现场快速部署中的应用。研究人员制备了针对东海原甲藻和中肋骨条藻的物种特异性单克隆抗体（MAbs），并建立了一套基于胶体金免疫层析（Colloidal Gold Immunochromatographic， GIC）试纸条的现场检测流程。该检测方法无需复杂仪器，在10-15分钟内即可提供半定量结果，其判读基于标准化的视觉观察（控制线有效性；检测线显色）以及可选的基于T/C值（检测线与控制线比值）趋势估算的图像分析。研究人员在筼筜湖固定站点评估了该方法的现场适用性，将试纸条结果与常规显微镜计数法进行比较，以评估其灵敏度、特异性和一致性。GIC试纸条能够在10-15分钟内实现现场快速定性识别目标物种，在标准化条件下显示出对非目标藻类的强区分能力。其操作检测限适用于阈值附近的早期预警，且检测线强度反映了不同站点间藻类丰度的空间差异。现场检测结果与显微镜计数法高度一致，支持其可靠地追踪站点水平的密度变化趋势，并证实了其在真实泻湖环境中的实际性能。这种基于GIC的方法通过将速度、简便性、现场便携性与物种级特异性相结合，解决了关键的监测空白，为有害藻华（Harmful Algal Blooms， HABs）管理提供了近实时的决策支持。该方法减少了对专业人员/设备的依赖，可作为快速筛查工具整合到常规监测中；未来的工作可以扩展物种覆盖范围（多联检），加强早期检测能力（例如，预富集、基于读取器的定量分析），并在更广泛的水生基质中验证其稳健性。

有害藻华（HABs）是指海洋浮游生物爆发性增殖导致海水异常变色的现象。在中国，广阔的海域、众多的入海河流以及持续变化的海洋生态环境共同作用，导致近年来赤潮事件日益频繁。河口、内湾和沿海水域的污染加剧，使富营养化恶化，显著增加了赤潮的频率和严重程度——尤其是甲藻藻华明显增多。尽管研究广泛，但赤潮形成的机制仍不完全清楚。一些赤潮致毒藻类会分泌毒素，毒害水生贝类和鱼类，导致海洋生物死亡、养殖贝类毒素蓄积，进而对海洋生态系统和水产养殖产生负面影响。这些事件也带来食品安全风险，威胁人类健康。在中国沿海，最常见的无毒赤潮致病种包括甲藻门的东海原甲藻和硅藻门的中肋骨条藻。这些物种已在山东等地多次引发具有不良后果的赤潮，是中国最普遍的HAB物种之一。近期研究表明，厦门湾赤潮群落正从硅藻主导向甲藻主导转变，但其根本原因尚不清楚。传统的藻类检测技术包括基于形态的显微计数法（MET）、基于分子生物学的定量聚合酶链式反应（qPCR）和DNA测序、基于免疫学的酶联免疫吸附测定（ELISA）和胶体金免疫层析，以及基于藻类色素的化学分析方法，如高效液相色谱（HPLC）、吸收光谱法（ASA）和荧光光谱法（FSA）。这些方法的共同局限性在于依赖实验室环境，需要复杂的样品预处理、专业技术人员或专用仪器。这些限制使其耗时且不适合实时监测或原位调查。胶体金免疫层析（GIC）是一种新型体外诊断技术，使用胶体金作为显色剂，硝酸纤维素膜作为载体来实现检测目标。开发基于GIC的试纸条来检测东海原甲藻和中肋骨条藻所携带的抗原，具有标记简单快速的优势。检测过程只需将水样滴加到试纸条上，显色反应时间仅需10-15分钟。该方法灵敏度高、特异性强，无需放射性同位素或潜在致癌的酶显色底物，也不需要荧光显微镜等设备。这些特点使其成为现场、原位赤潮监测和快速定性分析的有前途的工具，应用前景广阔。在本研究中，研究人员开发并验证了针对福建沿海水域两种主要赤潮藻——东海原甲藻和中肋骨条藻的胶体金免疫层析（GIC）试纸条。实验室实验证实，该试纸条具有高灵敏度和特异性，检测限适用于有害藻华的早期预警。在筼筜湖的现场应用进一步证明了其实用性和可靠性：试纸条提供的定性物种识别结果与传统显微镜检法一致，并且通过检测线强度捕捉到了藻类丰度的站点间变化趋势。通过实现无需专业设备或技术专长的快速现场检测，该方法为赤潮事件的实时监测和管理提供了有价值的工具。将这些试纸条成功整合到现场监测中，突显了其在赤潮易发区域改进早期预警系统和保护海洋生态系统的潜力。本研究开展于《Frontiers in Marine Science》。

本研究使用了几个主要的关键技术方法。首先，研究人员通过动物免疫和杂交瘤技术制备了针对东海原甲藻和中肋骨条藻的特异性单克隆抗体（MAbs）。其次，采用柠檬酸三钠还原法合成纳米胶体金颗粒，并将筛选出的高效单克隆抗体与胶体金标记，构建了免疫胶体金复合物。第三，组装了包含样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC膜）检测层和吸水垫的GIC试纸条，其中NC膜上固定了检测线（T线，包被目标藻MAbs）和控制线（C线）。第四，通过制备藻细胞标准溶液、细胞提取物、培养基和未稀释培养液，验证了试纸条对目标藻不同组分的反应有效性。第五，采用梯度稀释法测定了试纸条对目标藻的检测灵敏度（检测限LOD和定量限LOQ）。第六，使用十种常见赤潮藻的单种及混合藻液体系评估了试纸条的物种特异性。第七，在厦门岛西部的半封闭泻湖——筼筜湖的八个固定站点开展了为期一年的现场应用验证，将试纸条显色结果与显微镜计数结果进行了比对分析。

本研究的结果如下。首先，在单克隆抗体制备与筛选方面，针对东海原甲藻获得了10株单克隆抗体细胞株，其中9号和10号具有高滴度（P/N值分别为2.8和3.5，稀释度10³）；针对中肋骨条藻获得了17株单克隆抗体细胞株，其中3号、14号、15号和17号具有高滴度（在1:10⁵稀释度下，P/N平均值为4.74–8.80）。这些高滴度抗体被用于试纸条开发。其次，在试纸条有效性验证方面，试纸条与目标藻的藻细胞标准溶液、细胞提取物、培养基和未稀释培养液均发生反应，表明其可识别藻细胞及其分泌的胞外抗原。其中藻细胞标准溶液的显色反应最强，细胞提取物次之，培养基和未稀释培养液显色强度相近。第三，在灵敏度验证方面，东海原甲藻试纸条的检测限（LOD）约为535个细胞/毫升，定量限（LOQ）约为3.4×10⁴个细胞/毫升；中肋骨条藻试纸条的检测限（LOD）约为4,094个细胞/毫升，定量限（LOQ）约为6.5×10⁵个细胞/毫升。通过灰度扫描建立的藻密度与显色百分比的回归曲线（r² = 0.96）可用于半定量估算。第四，在特异性验证方面，单种藻测试显示，仅目标藻（东海原甲藻或中肋骨条藻）在试纸条上产生清晰的T线显色，其他非目标藻类及PBS对照均无显色。混合藻测试表明，即使在多物种混合体系中，只要含有目标藻，试纸条即可产生T线显色，且显色强度随目标藻浓度降低而减弱；不含目标藻的混合体系则无显色，证实了试纸条具有强物种特异性。第五，在现场应用验证方面，在筼筜湖8个站点的年度监测中，试纸条检测结果与附近日期的显微镜计数结果基本一致。例如，2024年5月15日、7月7日和2025年1月19日的试纸条结果显示中肋骨条藻在多个站点检出，与筼筜湖保护中心提供的显微镜数据吻合。试纸条检测线的灰度强度变化能反映站点间藻类密度的趋势差异。

论文的讨论与结论部分指出，本研究开发的胶体金免疫层析（GIC）试纸条为检测沿海水域中的东海原甲藻和中肋骨条藻提供了一种快速、便捷且有效的方法。试纸条表现出高特异性和灵敏度，其检测限适用于有害藻华（HABs）的早期预警。在筼筜湖的现场验证证实试纸条结果与传统显微镜检查结果一致，支持其在实际应用中的可靠性。与显微镜和分子技术（如qPCR）等常规检测方法相比，GIC试纸条在速度、简便性和现场适用性方面具有显著优势。传统显微镜检查需要熟练人员且耗时，分子方法虽然灵敏度高、特异性强，但依赖昂贵设备和复杂的样品制备。相比之下，试纸条可直接在现场使用，所需培训极少，且能在10-15分钟内给出结果。然而，试纸条目前限于定性或半定量检测，且仅针对特定目标物种。其在检测低丰度物种或在高度复杂的混合物中的性能可能受到交叉反应或基质效应的影响，这需要进一步评估。此外，尽管试纸条对沿海海洋环境具有稳健性，但其在淡水系统或具有不同理化性质的河口等其他水生环境中的有效性仍有待测试。文中描述的方法可通过开发针对其他目标的单克隆抗体扩展到其他有害藻类。可以设计多重检测试纸条来同时检测多个物种，提高对混合藻华的监测效率。此外，将其技术调整用于各种水生环境，包括淡水湖泊、河流和养殖池塘，将拓宽其应用范围。未来的研究应侧重于提高试纸条的定量能力、扩大可检测物种范围，并在不同环境条件和样品基质中验证其性能。重要的是要注意，试纸条当前的灵敏度虽然适用于当细胞密度接近藻华阈值时的快速确认，但对于亚阈值浓度的真正早期预警检测可能不足。为了进一步改进试纸条作为早期预警警报工具，应考虑采用样品预富集（例如，注射器过滤或温和离心）、使用便携式读取器进行定量分析以及优化检测化学（包括高亲和力抗体和信号放大）等策略。此外，开发针对多个主要或高风险物种的多重检测试纸条将提高其在监测混合群落和复杂现场样品中的实用性。建议进行基质标准化并纳入适当的对照，以最小化在多样化水生环境中的假阳性或假阴性。总之，为东海原甲藻和中肋骨条藻开发的GIC试纸条为沿海水域有害藻类的快速检测提供了实用高效的工具。与传统方法相比，其优势在于使用简便、结果快速且适合现场部署。尽管在物种覆盖范围、定量准确性和用于早期预警应用的灵敏度方面存在当前局限性，但持续的改进和更广泛的验证将进一步增强其实用性。该技术在有害藻华的早期预警和常规监测方面都具有前景，有助于保护海洋生态系统和公共卫生。进一步开发以涵盖更多物种、适应各种水生环境并与其它监测工具整合，将最大化其在环境管理和研究中的影响力。