《BMC Methods》：Optimized multiscale imaging of transplanted human pericytes in regenerating mouse skeletal muscle in vivo
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为解决肌营养不良等神经肌肉疾病细胞疗法中周细胞（pericytes）体内存活、分布与融合能力不清的难题，研究人员利用乙醇-肉桂酸乙酯（ethanol-ECi）组织透明化结合光片荧光显微镜（LSFM）与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），建立多尺度成像新方法，首次在急性损伤小鼠模型中三维可视化了移植人源周细胞的分布，并证实其参与肌肉再生，为优化细胞疗法评估提供了有力工具。
骨骼肌是我们身体运动的发动机，但当它患上像肌营养不良这类遗传性疾病时，肌肉会逐渐萎缩、无力，给患者的生活带来巨大痛苦。尽管医学界一直在探索用干细胞来修复受损的肌肉，但许多尝试，比如移植卫星细胞或成肌细胞，效果并不理想，因为这些细胞在移植后容易死亡，也很难迁移到需要它们的地方。这时，一种名为“周细胞”（pericytes）的细胞进入了科学家的视野。它们天生就住在血管周围，具有出色的迁移能力，甚至可以通过全身注射的方式抵达病灶，因此在治疗肌营养不良的动物实验中展现出了希望。然而，先前一项在杜氏肌营养不良患者中开展的同种异体（来自HLA匹配供者）周细胞临床试验效果却非常有限。这提示我们，要让人体自身的（自体的）周细胞成为有效的疗法，或许还需要结合基因编辑等技术。但一个更根本的问题横亘在面前：我们对于移植到体内的周细胞究竟命运如何——它们能存活下来吗？它们去了哪里？它们最终能和受损的肌肉融合，成为新的肌纤维吗？——了解得还远远不够。传统的研究方法要么费力耗时，要么缺乏整体空间信息。为了解开这些谜团，并为未来更有效的细胞疗法铺平道路，一项发表在《BMC Methods》上的研究，开发并应用了一种创新的多尺度成像“流水线”，首次在三维层面上清晰捕捉了人源周细胞在再生小鼠肌肉中的“一举一动”。
为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。他们使用免疫缺陷的Rag2-/-小鼠，通过向其胫骨前肌注射心脏毒素（cardiotoxin, CTX）来建立急性肌肉损伤再生模型。接着，将从健康人骨骼肌中分离培养的原代周细胞，在损伤后24或48小时注射到小鼠肌肉中。一个月后，研究人员取出肌肉样本，采用乙醇-肉桂酸乙酯（ethanol-ECi）组织透明化方案进行处理，使整个肌肉变得透明。随后，他们使用人特异性的lamin A/C抗体对移植的人细胞核进行免疫标记，并利用光片荧光显微镜（light sheet fluorescence microscopy, LSFM）对整个肌肉进行三维成像，以观察人源细胞的整体分布。基于LSFM的结果，他们再选取感兴趣区域制作冰冻切片，并使用层粘连蛋白（laminin）标记肌肉基底膜，通过共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）进行高分辨率成像，精确分析细胞定位及其与肌纤维的关系。
结果
CTX诱导的肌肉损伤与再生：研究首先确认了CTX注射能在小鼠胫骨前肌有效诱导急性损伤和随后的再生过程。一个月后，在损伤肌肉中观察到了再生的典型特征——中央化细胞核，而未注射CTX的对照肌肉（如腓肠肌）则显示正常的周边核位置，证明了损伤的区域特异性。
三维整体可视化揭示细胞分布模式：通过LSFM对透明化的整个肌肉进行成像，研究人员在几乎所有注射了人周细胞的肌肉中都检测到了人源细胞核（lamin A/C阳性）信号，而在仅注射缓冲液的对照肌肉中则没有。分析发现，移植细胞的分布存在变异性。在约一半的样本中，细胞主要聚集在肌肉的外周（肌外膜下）。
高分辨率切片分析精确定位细胞命运：在LSFM的引导下，对选定区域进行CLSM高分辨率成像，提供了更精确的细胞定位信息。分析发现，人源周细胞展现出多种存在状态：
- 1.
位于肌外膜下：部分细胞位于肌肉最外层的结缔组织（肌外膜）下方，未融入肌纤维。
- 2.
位于肌纤维间质：许多细胞位于肌纤维之间的空隙中，有些似乎紧贴着肌纤维的基底膜。
- 3.
融入肌纤维内部：最关键的是，研究明确观察到了人源细胞核位于小鼠肌纤维内部的情况，这为“移植的人周细胞能够与宿主肌纤维融合并直接参与肌肉再生”提供了直接证据。
讨论与结论
本研究成功建立并验证了一个结合组织透明化、LSFM三维整体成像和CLSM高分辨率分析的多尺度成像平台。该方法的优势在于，它能快速筛查整个器官内移植细胞的宏观分布，为后续的精细分析提供空间背景指导，从而显著提高了分析效率并降低了成本，同时保持了样本的完整性用于深入检查。
研究证实，在急性损伤后局部注射人源周细胞，一个月后仍能在小鼠肌肉中检测到存活的细胞。更重要的是，通过CLSM，研究者直接观察到了人源细胞核位于肌纤维内部，这为周细胞的肌源性（成肌）潜能及其在体内参与肌肉再生的能力提供了有力证据。然而，研究也揭示了细胞定位的高度变异性，许多细胞聚集在注射部位外围或停留在肌纤维之间，这可能与注射技术（如注射体积、深度）有关，提示了细胞递送策略标准化的重要性。
此外，讨论部分提出了一些重要的技术考量。例如，当人细胞核与小鼠细胞核在融合的肌纤维中共存时，人特异性核蛋白（如lamin A/C）可能会发生“核蛋白扩散”，导致信号减弱，可能低估成功融合的细胞数量。未来研究可采用人特异性DNA原位杂交等补充技术来更准确地进行定量。观察到的位于肌纤维基底膜附近的周细胞，提示它们可能占据了通常由卫星细胞驻留的肌肉干细胞“生态位”，其干性特征值得进一步探究。
综上所述，这项研究不仅为评估周细胞等治疗性细胞在体内的命运（包括存活、分布和融合）提供了一个强大、多功能的成像方法学平台，而且获得了关于人源周细胞在再生肌肉中行为的新见解。这些发现支持了周细胞作为神经肌肉疾病细胞疗法来源的潜力，并强调了优化细胞递送方案对未来治疗成功的关键作用。该方法可广泛适用于追踪不同器官中移植细胞的命运，从而加强再生治疗干预措施的临床前评估。
