基于快速悬浮技术的旋毛虫（Trichinella）、肺吸虫（Alaria）和肉孢子虫（Sarcocystis）在生肉及加工肉制品中的检测方法

《International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife》：Rapid suspension-based screening of Trichinella, Alaria and Sarcocystis spp. in game and processed meat

　　亚历山德拉·尤哈斯 | 加博尔·马约罗什
匈牙利布达佩斯塞梅尔维斯大学医学微生物学研究所，邮编H-1089

**摘要**
食源性人畜共患病每年影响全球近10%的人口，其中寄生虫病占这些感染的很大比例。与人畜共患病相关的肉源性寄生虫包括旋毛虫属（Trichinella spp.）、肉孢子虫属（Sarcocystis spp.）和翼形吸虫（Alaria alata），它们可以通过猪肉和其他肉类传播。尽管在猪群中已经采取了有效的控制措施，旋毛虫病仍然是一个重要的公共卫生问题。本研究介绍了一种简单、快速的悬浮液检测方法，用于检测新鲜和加工肉类中的主要肉源性寄生虫。该方法适用于实验室设备有限的快速现场检测。从自然感染的野猪肌肉中提取了包裹的旋毛虫幼虫和翼形吸虫中间尾蚴，并将其添加到未感染的猪肉、绞肉和香肠中（每50克添加5个胶囊和5个幼虫；n=15）。样品与水混合后过滤，用尼罗蓝或中性红染色，再用稀释的醋酸清洗，然后在立体显微镜下观察。在受控添加条件下，所有添加的旋毛虫和翼形吸虫幼虫都在实验样品中被检测到，相当于每50克样品中检测到5个幼虫。这些发现反映了实验室条件下的观察结果，并不代表正式验证的诊断性能参数。该方法还能观察到肌肉纤维中的死亡或钙化的旋毛虫胶囊和肉孢子虫囊肿，证明了其在检测肌肉组织中多种寄生虫方面的适用性。虽然这种方法不能替代官方的消化测试，但它为检测新鲜和加工组织中的多种肉源性寄生虫提供了一种实用的工具，有助于资源有限的地区的现场诊断和研究，支持食品安全监测、公共卫生以及野生动物或家畜群体中的寄生虫共感染研究。

**1. 引言**
食源性人畜共患病，尤其是通过肉类传播的疾病，是全球重要的公共卫生问题，寄生虫感染对此类疾病负担贡献显著（Kagira等人，2009；Djurkovi?-Djakovi?等人，2013）。放养养殖的普及、野味肉的消费以及有机生产系统的增加可能会由于野生动物与家畜之间的更密切接触而增加人类接触肉源性寄生虫的风险。其中，旋毛虫属、翼形吸虫属和猪带绦虫（Taenia solium）经常在猪肉和野味中被检测到（Freeman等人，1976；Korpysa-Dzirba等人，2021；Klich等人，2022；Malone等人，2024）。

旋毛虫属和翼形吸虫属具有特别重要的人畜共患病意义。这两种寄生虫通常与食用野猪（Sus scrofa）肉有关（Ch’ung-sung，1958；Casta?o等人，2014；Bandino等人，2023）。尽管有效的控制计划减少了家猪中的旋毛虫感染，但野生动物维持的野外循环仍然构成风险（Rostami等人，2017；Gherman等人，2022；Pozio，2022）。1986年至2009年间，全球报告了约66,000例人类病例（Murrell和Pozio，2011）。旋毛虫属能够在多种宿主和环境中生存，这使得其控制变得复杂（Wakelin，1993；Gottstein等人，2009；Hill等人，2010）。虽然严重或致命的病例很少见，但人类旋毛虫病强调了持续监测和预防措施的必要性（Rostami等人，2017）。同样，翼形吸虫在欧洲的野猪中广泛存在，其中间尾蚴已在生的或未煮熟的野味肉中被检测到（Edwards等人，2014；Korpysa-Dzirba，2021）。由于旋毛虫属和翼形吸虫属可能同时存在于同一宿主体内，因此开发能够检测多种肉源性寄生虫的诊断方法变得越来越重要。此外，野猪也可能携带肉孢子虫属，其中一些是可以通过未煮熟的肉类传播的人畜共患病（Dubey等人，2015；Rosenthal，2021；Brown等人，2025）。

分子方法具有高灵敏度，可用于寄生虫鉴定（Gazzonis等人，2019），但需要实验室基础设施，限制了其在现场条件下的应用。标准的人工消化技术是检测旋毛虫属的金标准；然而，这种方法耗时、成本高，且无法同时检测肉类中可能存在的其他人畜共患病寄生虫（N?ckler等人，2000；Noeckler等人，2019）。这里描述的基于悬浮液的方法为快速现场检测家养和野生动物中的肉源性寄生虫提供了一种实用的补充方法。我们提出了一种简化的基于悬浮液的方法，可以同时检测旋毛虫属、翼形吸虫属和肉孢子虫属，不仅适用于生肉，也适用于寄生虫已经死亡且其结构不会对抗人工消化液溶解效果的加工肉。这种低成本、适用于现场的方法增强了食品安全监测和家养及野生动物中的寄生虫学监测。

**2. 材料与方法**
2.1. 样品制备
从自然感染旋毛虫属的野猪（Sus scrofa）尸体中提取肌肉样本，通过压片技术检查以发现包裹的旋毛虫幼虫。手动从自然感染的野猪样本中切除包裹的旋毛虫幼虫及其周围的少量肌肉组织。从每个野猪肌肉样本中取出含有5个旋毛虫胶囊的肌肉块，并将每组5个胶囊均质化到50克不含旋毛虫的猪肉中。同样的添加程序也应用于不含旋毛虫的绞肉和商业生产的猪肉香肠（每50克添加5个包裹的旋毛虫幼虫）。每种肉类类型制备五个重复样本（每个矩阵5个独立的50克样本）。此外，在每种肉类的每个50克重复样本中添加5个翼形吸虫中间尾蚴（每个矩阵5个重复样本）。野猪肌肉样本自然含有肉孢子虫囊肿，因此这些囊肿也存在于添加了寄生虫的测试样本中。这些囊肿在未染色的压片制备物中不可见，但可以通过所描述的基于悬浮液的方法检测到。

猪肉、绞肉和香肠样本被剪切成约1立方厘米的小块。样品在添加寄生虫后1小时内进行处理，并在室温下储存以备分析。每个50克样本放入家用搅拌机（Tefal Blendforce II，型号BL420840，600瓦；Tefal集团，法国Rumilly）中，加入足够的冷水（约200毫升）淹没刀片，以全速搅拌3-4分钟以获得均匀的悬浮液。将悬浮液用自来水稀释至最终体积1升，以便后续过滤。

2.2. 过滤和沉淀
将悬浮液通过1.0-2.0毫米的筛网过滤到1升塑料桶中。搅拌机容器用冷水冲洗，冲洗液通过筛网过滤到桶中。筛网或搅拌机刀片上残留的组织碎片（可见的结缔组织和脂肪）被丢弃。将悬浮液用额外的冷水稀释，并在室温（约20-22°C）下静置7-8分钟。小心地倾倒上清液，然后加入清水重复沉淀过程。重复此冲洗和沉淀步骤2-3次，直到上清液中没有脂肪滴，并且在底部观察到细小的浅粉色肌肉碎片。

2.3. 染色和显微镜观察
将约5毫升的沉淀物转移到培养皿或白色瓷板上。向沉淀物中加入尼罗蓝或中性红染料溶液（0.5-1毫升用于1%溶液或3-4毫升用于0.1%溶液），混合直至悬浮液略微着色。染料附着在固体颗粒上，周围的水几乎变为无色。为了增强对比度和可见性，逐滴加入10%的醋酸，直到背景清晰（通常需要8-10滴）。醋酸通过去除肌肉纤维中的染料来清除背景，而不会使更致密的结构（如旋毛虫胶囊和其他覆盖有膜层的寄生虫）褪色。使用立体显微镜在20-30倍放大倍数下观察样品（双目镜，10倍物镜，0.5-5倍目镜），采用顶部照明。如果存在旋毛虫胶囊，可以识别出纺锤形结构，根据使用的染料不同，它们会呈现蓝色或红色。选择尼罗蓝和中性红是因为它们对含有大量细胞核或坏死物质的致密结构有很强的亲和力。这确保了即使在醋酸处理后也能在立体显微镜下获得高可见性。至少20倍放大倍数的立体显微镜和顶部照明足以进行观察。最佳设置包括带有10倍物镜和0.5-5倍目镜的双目立体显微镜。如果需要，可以在更高放大倍数下进一步验证胶囊内的幼虫形态或其他寄生虫的存在。

**3. 结果**
在15个实验室制备的样品上评估了基于悬浮液的方法，这些样品包括猪肉、绞肉和香肠，每50克未感染肉中分别添加了5个包裹的旋毛虫幼虫和5个翼形吸虫中间尾蚴（n=15）。同时还包括了同一组织中自然存在的未知肉孢子虫囊肿（表1）。所有人工添加的旋毛虫和翼形吸虫幼虫都在实验样品中被检测到，相当于在受控实验室添加条件下每50克样品中检测到5个幼虫。未进行正式的检测限评估。该方法还能检测到钙化和坏死的旋毛虫胶囊以及肉孢子虫囊肿，而这些通过压片或消化方法无法观察到。

**表1. 使用基于悬浮液的方法在不同肉样类型中检测添加的旋毛虫幼虫、翼形吸虫中间尾蚴和肉孢子虫囊肿**
| 样品类型 | 添加的旋毛虫胶囊和翼形吸虫中间尾蚴数量 | 样品重量（克） | 旋毛虫胶囊和翼形吸虫中间尾蚴的检测结果 | 备注 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 猪肉块 | 5-5 | 50 | 阳性（5/5） | 样品中含6个肉孢子虫囊肿 |
| 绞肉 | 5-5 | 50 | 阳性（5/5） | 样品中含7个肉孢子虫囊肿 |
| 香肠 | 5-5 | 50 | 阳性（5/5） | 样品中含9个肉孢子虫囊肿 |
| 总计 | 15-15 | 150 | 15/15阳性 | 22个肉孢子虫囊肿 |

在立体显微镜下，清晰可见纺锤形的旋毛虫胶囊，其中含有完整的幼虫，根据使用的染料不同，保持强烈的蓝色或红色。由于密度较高，染色后的胶囊在倾倒后比破碎的肌肉纤维更快沉淀到底部（图1，图2），从而与周围的组织碎片明显区分开来。幼虫周围的代谢残留物（主要是磷脂和降解物质）也保留了染料，增强了视觉对比度。

**图1. 旋毛虫囊肿和幼虫的大小比较及可视化**
A) 培养皿中的旋毛虫囊肿与火柴棒的大小比较，用中性红染色（囊肿大小：约500微米）。
B) 用尼罗蓝染色的野猪培养皿中的旋毛虫胶囊（黑色箭头）和肉孢子虫囊肿（白色箭头），放大倍数50倍。

**图2. 使用差异染色检测的旋毛虫属和其他寄生虫**
A) 用尼罗蓝染色的旋毛虫胶囊及其幼虫，放大倍数700倍。
B) 用中性红染色的旋毛虫胶囊及其幼虫，放大倍数700倍。

缺乏活幼虫的胶囊显示出稳定且明显的染色，可以识别出钙化或死亡的旋毛虫幼虫（图3）。尽管随着酸暴露时间的延长染色强度逐渐减弱，但在整个观察期间仍足以进行可靠的显微镜评估。

该方法在所有样品类型中表现一致，包括脂肪含量高的样品如绞肉和香肠，且未降低寄生虫的检测能力。偶尔会观察到无机颗粒（如石灰沉淀），但可以很容易区分，因为它们不保留染料或形状不规则。整个测试过程（包括样品制备和设备清洁）每个操作员大约需要一小时。

除了旋毛虫和翼形吸虫外，基于悬浮液的方法还能在同一肌肉样本中同时检测肉孢子虫囊肿（图4），并识别出共存的寄生虫，如翼形吸虫中间尾蚴（图5）。由于缺乏含有此类寄生虫的测试样本，我们无法更精确地确定该方法的灵敏度，但显然可以以这种方式检测多种寄生虫。肉孢子虫属（Sarcocystis spp.）的囊泡从肌肉纤维中释放出来，使用尼罗蓝（Nile blue）染色后显示出类似的颜色，并且大小与旋毛虫（Trichinella）的囊泡相当，这有助于提高诊断的准确性。（1000倍放大）下载：下载高分辨率图片（946KB）下载：下载全尺寸图片图5. 使用悬浮法对肌肉组织中的肺吸虫（Alaria）幼虫进行尼罗蓝染色，从而提高了诊断范围。（200倍放大）4. 讨论4.1. 测试方法的原理肉类中寄生虫的平均密度总是略高于周围肌肉组织的密度，因为它们每单位体积包含的细胞（细胞核）比肌肉组织多。因此，在悬浮的组织碎片中，寄生虫会比肌肉纤维更快地沉淀下来。该方法中使用的染料对寄生虫的染色比含有少量细胞核的肌肉组织更强烈，因为寄生虫含有更多的磷脂，在其被破坏后会产生更多的脂肪酸。长期以来，中性红（Neutral red）和尼罗蓝（Nile blue）一直被用于组织学检查（Romeis, 1948），也适用于寄生虫的选择性染色。这些染料也可以用来使死寄生虫可见，并识别肿瘤细胞（Lin et al., 1991）。醋酸比寄生虫更快地渗透到肌肉纤维中，因此在酸的作用下，寄生虫褪色的速度较慢。4.2. 简化悬浮法检测肉源性寄生虫的优点和缺点悬浮法在野外条件和农村地区特别有用，因为这些地方难以获得认证的实验室，使得可以用最少的资源进行现场检测。人工消化仍然是国际上公认的旋毛虫检测参考方法（Forbes and Gajadhar, 1999）。基于悬浮的方法并不旨在取代规范的检测协议，但可以作为野外条件下的补充探索工具。与消化法不同，消化法会溶解非活的幼虫和囊泡，而悬浮技术可以保留活的和非活的结构，这可能提供额外的流行病学信息。然而，需要正式的比较验证研究来确定其相对于现有方法的诊断性能。通过检测钙化的和坏死的幼虫以及活的幼虫，该方法补充了标准的人工消化和旋毛虫镜检方法，提供了可能被忽略的额外流行病学信息。与旋毛虫镜检相比，该方法可以处理更大的样本量，并且在野外条件下也能检查更大的样本量。这些特点使其成为提高食品安全监测的宝贵补充工具，尤其是在资源有限的情况下。悬浮法有效地分离了脂肪和结缔组织等干扰成分。脂肪滴在倾倒过程中漂浮并被去除，而结缔组织纤维则粘附在搅拌器叶片上或被过滤器截留。残留的脂肪在醋酸作用下呈现出特有的红棕色，即使在高脂肪基质（如绞肉或香肠）中也能轻松区分出寄生虫结构。那些可能从囊泡中逃逸出来的旋毛虫幼虫以及尚未在肌肉细胞内沉淀的幼虫颜色较浅，但如果它们是活的，可以通过其运动轻易识别。不幸的是，如果这些幼虫在测试过程中已经死亡而不移动，它们就不如完整的旋毛虫囊泡那么显眼。（使用消化法可以更好地识别来自原始组织的活的裸露幼虫。）根据所建议的方法，囊泡的独特外观和颜色使得幼虫的存在易于识别。该方法也适用于随后重新水化的干肉样本，尽管有时囊泡会相互粘附，导致染色效果减弱，但仍能进行视觉识别。在用温和酸或10%醋处理的腌制肉中，囊泡通常会分解，只留下颜色较浅的死幼虫，这需要经验丰富的操作者才能识别。尽管存在这些限制，悬浮法似乎适合检测各种类型的肉中的旋毛虫、肺吸虫和肉孢子虫，包括通常是非活的干制品（如香肠和火腿）。在特异性方面，该方法在欧洲那些囊化旋毛虫物种和其他食源性人畜共患病寄生虫流行的地区特别相关（Pozio, 2019）。囊化幼虫比自由形式的幼虫更容易与其他线虫幼虫区分开来，后者可能与无关分类群的物种相似。根据目前的实验结果（每50克样本中有5个幼虫），该方法在受控实验室条件下显示出成功的回收率。然而，正式的灵敏度、特异性和检测限参数仍需在未来的验证研究中确定。未来的研究应侧重于现场验证和与现有消化方法的定量比较，以全面定义灵敏度和特异性参数。与传统的光学显微镜下的旋毛虫镜检方法（Kohler and Ruitenberg, 1974）相比，基于悬浮的方法可能有助于在密集或加工过的肉基质中改善可视化效果；然而，需要直接的比较验证研究。虽然额外的步骤（如将悬浮液涂在载玻片上或使用压缩器）可以提高可见性，但可能会增加检测时间。悬浮法不会溶解组织，因此也可以检测被酶溶解的寄生虫。这在家猪或野猪携带其他食源性人畜共患病寄生虫（如肉孢子虫囊泡）的情况下非常有益（Helman et al., 2023）。肉孢子虫在屠宰时不会产生可见的病变（Rubiola et al., 2024），但其频繁出现可以作为应用悬浮法时的内部程序控制。这些原生动物囊泡由于其高频率和与旋毛虫囊泡相似的行为，有助于检查者校准对寄生虫结构的视觉识别，从而提高诊断准确性（图4）。此外，该方法还可以检测可能与旋毛虫幼虫共存的肺吸虫中间尾蚴（Alaria alata mesocercariae），提供进一步的诊断信息（图5）。4.3. 肌肉悬浮检测技术中的潜在局限性像任何诊断方法一样，悬浮法的可靠性取决于仔细的操作。悬浮液中的组织密度过高或培养皿中的分布不均可能会掩盖寄生虫，而倾倒不完全可能会留下干扰染色的漂浮碎片。因此，在施加染料之前，正确的倾倒和清洗是必不可少的。对于陈年或加工过的肉样本（如熏制火腿或长期冷冻的组织），由于染料扩散减少，染色强度可能会降低。通过调整染色时间和染料浓度可以补偿这种效应。由于旋毛虫囊泡的密度不同，寄生虫通常集中在悬浮液的底部；因此，建议检查多个培养皿并关注沉淀层。可以通过添加额外的染料来增强微弱的染色效果，而过度染色可以通过反复用醋酸处理来纠正。为了避免气泡形成，应使用静止的水而不是新鲜抽取的自来水。4.4. 使用基于肌肉悬浮法的一些理由在屠宰场检查中，需要高诊断灵敏度，因为必须快速检测多只动物的混合样本。然而，当单独检查个体动物时，如果从易感染部位取较大的肌肉样本，通常可以使用不太敏感但更简单的方法检测到旋毛虫幼虫。这增加了即使在没有复杂实验室设施的情况下也能检测到幼虫的概率。虽然疾病严重程度通常与感染剂量相关，但即使是低水平的感染在流行病学上也是相关的。因此，任何适用于现场的筛查方法都应谨慎解释，并不能替代规范的检测协议（Dupouy-Camet, 2000; Murrell and Pozio, 2011; Malone et al., 2024）。基于悬浮的方法特别适用于快速筛查单个样本，尤其是在肉的来源或之前的实验室检测不确定的情况下。其简单性、速度和低成本使其适合现场兽医和私人从业者。尽管人工消化仍然是常规肉类检测的金标准，但悬浮法为识别旋毛虫、肺吸虫和肉孢子虫提供了一种实用的现场替代方法。其最低的设备要求和成本效益使其成为研究人员、检查人员和现场诊断人员的有吸引力的补充工具。这种快速方法在实践培训中向学生展示肉中的寄生虫也非常有用。当整合到当地监测计划中时，它可以通过促进缺乏认证实验室设施地区的单个样本检测来支持监管工作。总体而言，基于悬浮的方法是一种实用的现场探索工具，在受控现场条件下验证后具有潜在的补充价值。可以假设该方法还可以检测肉中的其他寄生虫（例如弓形虫囊泡、囊尾蚴、钩虫幼虫等），但我们还没有机会进行这些寄生虫的检测。5. 结论本研究提出了一种简化的悬浮方法，作为在没有认证实验室的情况下检测肉源性寄生虫的传统技术的实用且经济有效的替代方案。该方法在不同肉基质中的通用性和易用性使其适用于常规检查和紧急评估，特别是在资源有限或研究现场工作中。它能够检测活的、死的和钙化的旋毛虫幼虫、肺吸虫中间尾蚴和肉孢子虫，这突显了其补充现有诊断工具的潜力。虽然该方法不能替代为公共安全规定的人工消化方法，但它为单个肉样本提供了有价值的解决方案，特别是在难以获得专业设备的场景中。这与提高食品安全和控制人畜共患病这一更广泛的目标一致。它通过结合简单性和改进的可视化效果，弥合了传统旋毛虫镜检和酶消化方法之间的差距。未来的研究应侧重于大规模的现场验证、与消化方法的定量性能比较以及评估其在国家食品安全监测系统中的整合。CRediT作者贡献声明Alexandra Juhasz：撰写——原始草稿、可视化、资源收集、调查、数据分析、概念化。Gábor Majoros：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、监督、方法学、调查、数据分析、概念化未引用的参考文献Casta?o Zubieta et al., 2014; Dubey et al., 2016; Dupouy-Camet, 2000.伦理声明本研究不需要对作为常规狩猎管理控制计划一部分而被杀死的动物进行伦理批准。本研究中使用的野猪样本是出于诊断目的提交给兽医大学寄生虫学和动物学系的。