《Plant Biotechnology Journal》：Field Trials and Baking Studies of Ultra-Low Asparagine, Genome Edited (CRISPR/Cas9) and Mutant (TILLING) Wheat
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为解决食品加工过程中产生的潜在致癌物丙烯酰胺的食品安全问题，研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑和化学诱变（TILLING）技术，成功培育了天冬酰胺合成酶基因TaASN2（单独或与TaASN1联合）敲除的小麦品系。为期两年的田间试验表明，这些品系籽粒中的游离天冬酰胺含量最高可降低93%，并显著减少了面包、饼干等烘焙食品中的丙烯酰胺生成，且对产量无负面影响。该研究为从源头控制食品中丙烯酰胺污染、保障消费者健康及应对相关法规挑战提供了创新的作物育种解决方案。
金黄酥脆的面包片、香气扑鼻的饼干，这些烘焙食品的美味很大程度上归功于“美拉德反应”（Maillard reaction）——食物在加热过程中，氨基酸与还原糖发生的一系列复杂化学反应，带来了诱人的色泽和风味。然而，这个反应在带来美味的同时，也可能产生一个不受欢迎的“副产品”——丙烯酰胺。自2002年在常见食品中被发现以来，这种被国际癌症研究机构（IARC）归类为2A类致癌物（可能对人类致癌）的化合物，便成为了食品安全领域关注的焦点。丙烯酰胺主要由食物中的游离天冬酰胺在高温（>120°C）加工条件下形成，广泛存在于烘焙、油炸、烘烤的谷物、豆类和薯类制品中。
为了应对这一挑战，欧盟等监管机构设定了食品中丙烯酰胺的基准水平。对于食品企业而言，既要控制丙烯酰胺含量以符合法规，又要保持产品吸引消费者的色、香、味，是一项艰巨的任务。更棘手的是，作为丙烯酰胺形成的关键前体，小麦籽粒中的游离天冬酰胺含量极易受到气候、土壤养分（如硫缺乏会导致其急剧积累）和病虫害等环境与栽培管理因素的影响，年际和地域间波动很大。这使得食品企业难以预测原料的丙烯酰胺形成潜力，也为稳定生产符合标准的产品带来了不确定性。因此，从作物品种的遗传本质上入手，培育游离天冬酰胺含量低且稳定的新型小麦，被认为是解决这一难题的根本性策略。
近期，一项发表在《Plant Biotechnology Journal》上的研究为此带来了突破性进展。一个国际研究团队通过前沿的基因编辑技术和传统的化学诱变方法，成功获得了天冬酰胺合成酶基因敲除的小麦，并在为期两年的田间试验中验证了其降低食品中丙烯酰胺含量的巨大潜力。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和化学诱变剂EMS处理（TILLING， Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）分别构建了小麦天冬酰胺合成酶基因TaASN2的敲除或突变品系，其中包括仅敲除TaASN2的品系，以及同时部分敲除TaASN1和TaASN2的品系。其次，在英国洛桑研究所进行了为期两年（2022-2023和2023-2024生长季）的随机化田间试验，对编辑品系、诱变品系及其野生型对照（Cadenza和Claire品种）的农艺性状和籽粒成分进行了系统评估。最后，使用这些小麦籽粒磨制的全麦粉，按照标准工艺流程烘烤了面包和饼干，并采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）精确测定了成品中丙烯酰胺的含量，系统分析了基因编辑对最终食品安全指标的影响。
2.1 田间试验
研究在英国洛桑研究所的Pastures Field进行了两个年度的田间试验（试验代号2318和2418）。试验采用随机化设计，包括了通过CRISPR/Cas9编辑获得的TaASN2单敲除（如23.60, 23.75）、TaASN2/A基因组敲除（178.35）以及TaASN2敲除/TaASN1部分敲除（如59.26, 59.84）品系，以及通过TILLING获得的TaASN2突变品系（包括总敲除品系ABD）。每个品系设置多个重复小区，并以野生型品种Cadenza和Claire作为对照。
2.2 产量和千粒重
结合两年的数据进行分析发现，CRISPR编辑品系的整体产量与对照Cadenza相比仅略微降低1.1%，且这种差异不能归因于编辑本身或天冬酰胺水平的降低，因为部分编辑品系（如59.26, 59.84）的产量甚至略高于对照。然而，TILLING品系的产量则比其对照Claire显著降低了22.5%。在千粒重方面，编辑品系和TILLING品系均比各自的对照显著降低，表明它们可能产生了更多但更小的籽粒。
2.3 总氮、碳和硫
分析表明，干扰天冬酰胺合成并未降低籽粒的总氮含量（通常作为蛋白质含量的指标）。CRISPR编辑品系的总氮含量与Cadenza相近，而TILLING品系的总氮含量甚至显著高于Claire对照。总碳含量差异微小，总硫含量在品系间存在一定差异，但编辑品系的硫含量仍处于适宜水平。
2.4 游离天冬酰胺浓度
这是研究的核心指标。高效液相色谱（HPLC）分析显示，基因编辑对降低籽粒游离天冬酰胺含量效果极为显著。在两年试验数据合并分析中，与对照Cadenza相比，TaASN2单敲除品系（23.60, 23.75）的游离天冬酰胺降低了59%，而TaASN2敲除/TaASN1部分敲除品系（59.26, 59.84）的降幅达到了惊人的93%。TILLING总敲除品系（ABD）的游离天冬酰胺含量也比其对照Claire降低了50%。值得注意的是，尽管两个试验年度的生长条件恶劣（干湿交替），导致所有基因型的游离天冬酰胺含量均高于往年，但编辑品系的增长幅度远小于对照，表明其游离天冬酰胺积累受环境影响更小，稳定性更好。品系59.26和59.84的游离天冬酰胺浓度（0.16 mmol kg-1）远低于文献报道的现有小麦品种范围，创造了新低。
2.5 面包和饼干中的丙烯酰胺
烘焙实验直观地展现了低天冬酰胺小麦的食品安全价值。使用编辑和突变品系面粉制作的面包和饼干，其丙烯酰胺含量大幅下降。
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面包与吐司：未经烘烤的面包中，品系59.26的丙烯酰胺含量低于检测限，品系23.60的面包丙烯酰胺仅为Cadenza对照的14%，TILLING ABD品系的面包丙烯酰胺为Claire对照的21%。即使经过4分钟烘烤，品系59.26吐司的丙烯酰胺含量也仅为Cadenza吐司的8%，品系23.60的为23%，TILLING ABD的为46%。丙烯酰胺的形成与游离天冬酰胺浓度呈显著正相关，且吐司的相关性比面包更强。
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饼干：饼干中的丙烯酰胺减少同样显著。品系59.26饼干的丙烯酰胺比Cadenza对照降低了92%，品系23.60的降低了74%。TILLING ABD饼干的丙烯酰胺比Claire对照降低了62%。所有饼干的丙烯酰胺含量均远低于欧盟目前设定的350 μg kg-1基准水平。
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色泽与丙烯酰胺的关系：一个重要的发现是，在编辑和突变品系中，色泽（美拉德反应褐变程度）与丙烯酰胺形成之间的关系发生了改变。与对照相比，在达到相同褐变程度时，编辑/突变品系产生的丙烯酰胺更少。这意味着使用这些小麦原料，食品加工企业可以在不牺牲产品感官品质（色泽）的前提下，显著降低有害污染物水平。
3 讨论
研究结论与意义
本研究通过两年扎实的田间试验和烘焙分析，证实了利用CRISPR/Cas9基因编辑和TILLING技术敲除天冬酰胺合成酶基因TaASN2（尤其是与TaASN1联合敲除），可以实现在大田生产条件下，稳定、大幅地降低小麦籽粒游离天冬酰胺含量（降幅最高达93%），且不造成产量损失。这直接导致了以其为原料的烘焙食品（面包、吐司、饼干）中致癌物丙烯酰胺的急剧减少（吐司中可降低92%以上），部分产品中的丙烯酰胺甚至低于检测限。
这项研究的成功具有多重重要意义：
- 1.
源头控制食品安全风险：它提供了一种从农作物原料源头控制加工过程污染物形成的创新策略，有望从根本上降低消费者从主食中摄入丙烯酰胺的风险。
- 2.
应对法规与产业挑战：随着欧盟等地可能进一步收紧丙烯酰胺的限量标准，低天冬酰胺小麦品种可以帮助食品企业更轻松地达到法规要求，避免因原料波动带来的合规风险和生产成本增加，同时保持产品的感官品质。
- 3.
展示现代育种技术优势：研究对比了CRISPR编辑与TILLING两种技术路径。CRISPR编辑品系在实现大幅降低天冬酰胺的同时，保持了与野生型相当的产量，而TILLING品系则出现了显著的产量损失。这凸显了靶向基因编辑技术相对于随机化学诱变的精准性和优越性，为作物遗传改良提供了更高效、更可控的工具。
- 4.
推动政策与商业应用：这项研究发表在包括英国通过《遗传技术（精准育种）法》在内的政策变革期，为将无外源转基因的基因编辑作物（被视为精准育种生物）推向市场提供了有力的科学证据。商业化推广低丙烯酰胺潜力的小麦品种，将有助于构建更安全、可持续的食品体系。
总之，这项研究不仅是一项重要的科学突破，展示了合成生物学在解决重大食品安全问题上的应用潜力，也为连接“从农田到餐桌”的全产业链，协同保障消费者健康与产业健康发展，提供了切实可行的解决方案。
