《Andrology》：Testis-Enriched F-Box Protein FBXO39 Is Important for Spermiogenesis and Male Fertility in Mice
编辑推荐：
为探究两个睾丸特异性表达的F-box蛋白在雄性生殖中的功能，研究人员利用CRISPR/Cas9构建了Fbxo36和Fbxo39基因敲除小鼠。结果显示，Fbxo39敲除导致小鼠生育力低下、精子形态异常、运动力减弱，并伴随精子头部形成、核凝聚和线粒体鞘组装缺陷，证实了其在精子发生中的重要作用，为理解雄性不育病因提供了新的候选基因。
生命的传承始于一个健康、有活力的精子。然而，男性不育症正成为一个日益严峻的全球健康问题，其中很多病例的病因至今不明。在睾丸内，精子经历一个称为精子发生的精密而复杂的过程，其中任何一个环节出错都可能导致不育。科学家们发现，一种名为泛素-蛋白酶体系统(UPS)的细胞内“垃圾处理”机制，通过精准降解特定蛋白质，在许多生命过程中扮演“调控者”的角色。SCF (Skp1-Cullin-F-box)复合体是UPS中一类主要的E3泛素连接酶，而F-box蛋白则是SCF复合体中专司识别、结合待降解“底物”蛋白的关键成员。有趣的是，在众多F-box蛋白中，有一类FBXO蛋白在睾丸中高度富集，提示它们可能在精子发生中承担特殊使命。此前研究发现，Fbxo24、Fbxo43、Fbxo47对小鼠雄性生育力至关重要，而Fbxo15和Fbxo30则非必需。然而，仍有部分睾丸富集的FBXO蛋白，如FBXO36和FBXO39，其生理功能仍是未解之谜。为了揭开这两者的神秘面纱，一支由Y. K.， H. M. 和 M. I. 领导的研究团队展开探索，相关成果发表在《Andrology》期刊上。他们想知道：敲除这两个基因，会对小鼠的精子发生和雄性生育力产生怎样的影响？哪一个才是精子“合格出厂”过程中不可或缺的“质检员”？
研究人员综合运用了多种关键技术来解答上述问题。他们利用CRISPR/Cas9系统构建了Fbxo36和Fbxo39的基因敲除(KO)小鼠品系。通过对这些KO小鼠进行系统的表型分析，包括雄性生育力测试、睾丸和附睾的组织切片染色（如PAS染色）、精子形态和运动力计算机辅助分析(CASA)，以及利用透射电子显微镜(TEM)观察精子超微结构，全面评估了基因缺失的后果。此外，还通过体外细胞实验，如免疫共沉淀(Co-IP)，验证了FBXO36和FBXO39与SCF复合体核心组件SKP1的相互作用。研究中所用的基因修饰小鼠的精子将被保存在相关生物资源中心。
3.1 Fbxo36和Fbxo39在小鼠睾丸中富集且在人类中高度保守
研究人员通过分析已发表的转录组数据，确认了七个睾丸富集的Fbxo基因，其中包括本研究关注的Fbxo36和Fbxo39。RT-PCR证实两者在小鼠多种组织中特异性高表达于睾丸。进化分析显示，这两个蛋白在人和小鼠之间序列高度同源（分别达76.1%和83.7%）。单细胞RNA测序分析进一步揭示，Fbxo36的表达从粗线期精母细胞阶段开始增加，而Fbxo39的表达则在圆形精子细胞中期变得显著，且在人类睾丸细胞中表现出相似模式。AlphaFold3结构预测支持它们能通过F-box结构域与SKP1结合，形成SCF复合体。
3.2 破坏Fbxo36并未损害小鼠雄性生育力
通过CRISPR/Cas9技术，研究人员成功获得了携带大片段缺失的Fbxo36KO小鼠。生育力测试显示，KO雄鼠与野生型(WT)对照在产仔数上无显著差异。睾丸形态、重量、附睾精子形态以及睾丸和附睾的组织学切片均未发现明显异常。计算机辅助精子分析(CASA)显示，除曲线运动速度(VCL)有轻微但显著的下降外，其他运动参数无差异。这些结果表明，Fbxo36对小鼠正常的精子发生和雄性生育力并非必需。
3.3 破坏Fbxo39导致小鼠雄性生育力受损和精子发生缺陷
与FBXO36类似，体外实验证实FBXO39也能通过其F-box结构域与SKP1结合。研究人员同样利用CRISPR/Cas9获得了Fbxo39KO小鼠。交配实验表明，KO雄鼠的每窝产仔数显著减少，表明其生育力低下。虽然睾丸大体形态和重量正常，但组织学分析揭示了严重缺陷：睾丸切片显示，存在核凝聚不完全的伸长精子细胞，且异常残留的细长精子细胞增多；附睾切片中成熟精子数量显著减少，并可见异常转运的未成熟生精细胞。免疫荧光染色进一步证实了未成熟生殖细胞（DDX4阳性）异常出现于附睾管腔中。
3.4 Fbxo39KO精子表现出异常形态和受损运动力
对附睾尾精子的观察发现，KO精子频繁出现头部形态异常和/或尾部中断。CASA分析显示，KO精子的运动精子比例、前进运动精子比例以及平均路径速度(VAP)、直线运动速度(VSL)、曲线运动速度(VCL)等多个运动参数在孵育10分钟和120分钟后均显著降低。
3.5 分析揭示Fbxo39KO睾丸中精子头部和鞭毛形态存在缺陷
透射电子显微镜(TEM)超微结构分析提供了更深入的见解。在Fbxo39KO小鼠的睾丸中，伸长和细长精子细胞表现出核凝聚缺陷、头部塑形异常和顶体形成不完全。特别是在本应只有细长精子细胞的生精小管阶段V–VI中，仍可见异常的伸长精子细胞，表明核凝聚过程延迟或受阻。在附睾尾精子中，KO精子的细胞核显示出点状的电子致密图案，提示核凝聚模式改变。鞭毛结构也出现异常：睾丸精子细胞中线粒体鞘形成存在缺陷，而轴丝结构看似完整；但在附睾尾精子中，中段和轴丝均观察到缺陷，这可能是导致精子运动力下降的原因之一。
研究结论与重要意义
本研究系统阐明了两个睾丸富集F-box蛋白FBXO36和FBXO39在小鼠精子发生中的不同作用。结果表明，Fbxo36对雄性生育力是非必需的，而Fbxo39则是精子发生，特别是精子形成(spermiogenesis)后期的关键调控因子。Fbxo39的缺失导致一系列缺陷：包括精子头部塑形和核凝聚异常、顶体形成不完全、线粒体鞘组装缺陷，并最终引发轴丝结构异常、精子运动力下降和雄性生育力低下。这些缺陷可能与未成熟生精细胞异常滞留在睾丸和释放到附睾有关。
该研究的重要意义在于：首先，它明确了Fbxo39是雄性生育力所必需的基因，填补了睾丸富集FBXO蛋白功能谱系的最后一块拼图（图5总结了所有已知睾丸富集FBXO蛋白的KO表型）。其次，研究揭示了FBXO39通过其F-box结构域与SCF复合体核心组件SKP1相互作用，提示它可能作为SCF E3泛素连接酶的底物识别亚基，通过泛素-蛋白酶体途径降解精子形成过程中的特定靶蛋白，从而精密调控精子头部成熟和鞭毛组装。尽管头部畸形可能是原发性缺陷，但线粒体鞘和轴丝的异常也可能独立发生或由头部缺陷间接导致，具体机制有待后续对FBXO39底物的鉴定。最后，鉴于FBXO39在人和小鼠之间高度的序列和表达模式保守性，以及在人群基因组数据库（如gnomAD）中已发现其功能丧失性变异，该研究强烈提示FBXO39可能是人类男性不育症，特别是畸形精子症和/或弱精子症的一个新的候选致病基因。未来在男性不育患者中筛查FBXO39变异，并结合功能研究，将有助于揭示其临床相关性，为部分特发性男性不育症的诊断提供新的分子依据。
