《Journal of Molecular Structure》：Green synthesis of pyridazinone-linked 1,2,3-triazoles via CuAAC and evaluation of their anticancer activity and molecular docking studies
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绿色合成CuAAC反应制备的4,5-二氯吡啶并-3(2H)-酮连1,2,3-三唑杂合化合物4b具有显著抗癌活性，其IC50值（1.60-3.73 μM）优于前体炔烃2（2.52-7.81 μM），且对正常细胞毒性低，体外实验与分子对接（PDB:1m17）和ADMET预测结果一致。
Pooja Duhan | Ram Kumar Tittal | Bajrang Lal | Ruhi Singh | Roopam Singh | Ramling S. Mathpatia
印度哈里亚纳邦库鲁克谢特拉国家技术学院化学系，邮编136119
摘要
为了实现绿色合成，我们采用了一种环境可持续的“Click Green Atmosphere”CuAAC（铜催化叠氮-炔烃环加成）方法，制备了高纯度和高产率的4,5-二氯吡啶嗪-3(2H)-酮与1,2,3-三唑杂化物，这些杂化物被认为具有更安全、更选择性的抗癌活性。通过对乳腺癌（MDA-MB-231）、结直肠癌（HCT-116）、前列腺癌（PC-3）细胞系以及正常肾细胞系（HEK-293）的抗癌活性筛选，我们全面表征了这些三唑杂化物的特性。结果显示，这些杂化物表现出强烈的抗增殖作用，并且对正常细胞的细胞毒性较低，这一结论通过4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、线粒体膜电位（MMP）和磺罗丹明B（SRB）检测得到证实。化合物4b的IC50值分别为1.60、4.01、3.73和21.27 μM，其效果优于其前体炔烃2（IC50值分别为2.52、7.58、7.81和20.10 μM）。体外实验表明，4b能够抑制MDA-MB-231细胞的粘附、侵袭和迁移能力，这一结果得到了计算机模拟（in silico）分子对接（与表皮生长因子受体EGFR酪氨酸激酶结构PDB ID: 1m17）和ADMET预测的合理支持。
引言
癌症是一种由体细胞中的遗传或表观遗传变化引起的疾病，这些变化会导致细胞异常增殖并扩散到身体其他部位[[1], [2], [3]]。2018年全球报告了1800万例癌症病例[4]，其中男性950万例，女性850万例，死亡人数为960万[5,6]。世界卫生组织（WHO）估计到2030年将有1200万人死于癌症[7]。癌症的影响日益严重。主要致病因素包括烟草（22%）[[8], [9], [10]]、HIV（15%）等感染[11]，以及不良饮食、肥胖、过量饮酒和接触有害辐射[12]。根据世界癌症研究基金会（WCRF）的研究，某些饮食因素与癌症风险增加有“确凿”的关联，例如黄曲霉素与肝癌、红肉和/或加工肉类与结直肠癌、酒精与胃肠道癌症的关系，以及β-胡萝卜素补充剂与肺癌的关系[13]。
癌症主要是由于环境污染物[14]、香烟烟雾[15]、过度日晒[16,17]等因素导致自由基生成增加所致。这些自由基会损害细胞的所有关键成分，包括DNA。为了抵御体内的自由基，应养成摄入更多抗氧化剂的习惯，因为抗氧化剂有助于中和自由基[18]。癌症患者的初期症状可能包括虚弱[19]、体重下降[20]、肿胀[21]、食欲不振[22]和疼痛[23]。患者通常接受激素疗法、免疫疗法、放射疗法、化疗或这些方法的组合治疗[24]。最佳的癌症治疗方法是干细胞移植[25]，这需要在常规治疗后进行，包括帮助患者恢复血容量和整体健康状况的治疗。癌症在死亡原因中排名仅次于心脏病[26]，主要是因为现有的化疗方法无法有效区分健康细胞和癌细胞[27]。这些创新药物的主要目标是克服传统抗癌策略的缺点，如长期副作用和不良治疗后果[28]。因此，开发具有创新机制、疗效提升和副作用减少的抗癌药物始终是药物设计和发现领域的研究重点[29]。尽管有超过100种不同类型的癌症会危害人类健康，但全球最常见的癌症类型是前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌和非黑色素瘤皮肤癌[30,32]。如图1所示，2025年新诊断出的乳腺癌病例数量超过了肺癌等其他类型[33]。乳腺癌可分为三种主要临床亚型：激素受体（HR）阳性、人表皮生长因子受体2（HER2）阳性和三阴性乳腺癌（TNBC）。前两种亚型可以通过激素疗法单独或联合化疗治愈，但TNBC亚型较难治疗，因此需要化学家研发更有效的药物[34,35]。
在这一背景下，杂环化合物在新型抗癌药物的开发中起着重要作用。在杂环化合物中，1,2,3-三唑是一种具有重要药理特性的化合物，广泛应用于抗菌[36]、抗HIV[37]、抗癌[38]和抗过敏[39]等领域，因此受到了有机药物设计研究人员的广泛关注。大量先前的研究表明，1,2,3-三唑通过多种作用机制表现出抗癌活性[40]。它们通过阻断参与疾病进展的酶（如碳酸酐酶（CAs）[41]、胸苷酸合成酶（TS）[42]、芳香化酶、色氨酸[43]、2,3-双加氧酶（TDO）[44]、血管内皮生长因子受体（VEGFR）[45]和表皮生长因子受体（EGFR）[46]等）来发挥抗癌作用。1,2,3-三唑衍生物可以通过Cu(I)催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）[47]轻松合成。
有趣的是，4,5-二氯吡啶嗪-3(2H)-酮这种较少被研究的杂环化合物因其氮原子在羰基碳附近的独特排列而引起了研究人员的注意，这种排列赋予了它多种特性，例如具有高度碱性的π-缺陷芳香体系，pKa值为2.3，这有利于质子化、氢键形成和通过氮原子的螯合作用[48]。此外，4位和5位的两个氯官能团可以通过官能团转化进一步改良，从而增强原始吡啶嗪结构的生物学活性[49,50]。在药物开发中，4,5-二氯吡啶嗪-3(2H)-酮骨架的3位羰基是一个关键的药理组成部分，它通常作为氢键受体，能与与癌症相关的酶活性区域中的重要氨基酸残基形成强烈的结合亲和力，包括c-Met激酶、PARP（聚(ADP-核糖)聚合酶）和EGFR（表皮生长因子受体）[51]。先前的研究显示，4,5-二氯吡啶嗪-3(2H)-酮衍生物可以通过抑制特定蛋白质、酶或阻断各种受体来发挥抗癌作用，从而阻止癌细胞的增殖和分裂。吡啶嗪-3(2H)-酮对某些类型的癌症（如结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌）具有选择性[52], [53], [54], [55]]。它还能与多种靶标相互作用，如G蛋白偶联受体、核受体、离子通道相关受体和其他酶[56]。此外，目前尚未有报道将4,5-二氯吡啶嗪-3(2H)-酮与1,2,3-三唑连接起来的化合物。
鉴于上述观察结果以及本实验室利用分子杂交技术合成1,2,3-三唑杂化物的研究趋势[57,58]，我们计划设计并合成4,5-二氯吡啶嗪-3(2H)-酮与1,2,3-三唑杂化物（图2），并在环境可持续的CuAAC反应条件下进行制备。所得的4,5-二氯吡啶嗪-3(2H)-酮与1,2,3-三唑杂化物将被用于抗癌活性等生物应用的研究，其结果将通过分子对接数据得到验证。
结果与讨论
根据方案1所示，通过CuAAC反应将4,5-二氯-2-prop-2-炔基-2H-吡啶嗪-3-酮（2）与不同的苄基/苯基叠氮化物（3a-3o）反应，合成了4,5-二氯吡啶嗪-3(2H)-酮与1,2,3-三唑杂化物（4a-4o）。其中，苄基叠氮化物是在现场（in-situ）通过叠氮化钠和不同的苄基氯化物/溴化物制备的，而苯基叠氮化物则是通过不同的苯胺衍生物的硝化反应制备的。然而，底物2是通过烷基化反应制备的。
实验部分
1,2,3-三唑杂化物（4a-4o）的合成通用步骤
在含有磁棒的双颈圆底烧瓶中加入10毫升水和10毫升水，然后加入炔烃（1毫米摩尔）（2）、苯基或苄基叠氮化物（1毫米摩尔）（3a-3o）以及催化量的CuSO4·5H2O（30摩尔%）和Na-抗坏血酸（60摩尔%），在40-50°C下搅拌5-15分钟。反应完成后通过薄层色谱法（TLC）进行检测。反应完成后，将混合物过滤出来。
未引用的参考文献
[31]
CRediT作者贡献声明
Pooja Duhan：数据可视化、验证、调查、数据分析、数据管理。
Ram Kumar Tittal：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源协调、方法学设计、数据分析、概念构思。
Bajrang Lal：初稿撰写、数据可视化、软件应用。
Ruhi Singh：调查、数据分析、数据管理。
Roopam Singh：调查、数据分析。
Ramling S. Mathpatia：软件开发。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的研究工作。
致谢
本项工作得到了SAKSHAM加速创新与研究（PAIR）网络的支持，该网络由印度ANRF（Anusandhan国家研究基金会）资助，项目编号为ANRF/PAIR/2025/000018/PAIR，由印度印多尔技术学院管理和指导。作者感谢印度查谟技术学院和CIF Saptarshi提供的HRMS和XRD设施，同时感谢旁遮普大学昌迪加尔分校提供的NMR设施。
