大规模双向阵列CRISPR筛选揭示OXR1与EMC4为α-突触核蛋白聚集的关键调控因子

《FEBS Open Bio》：Large-scale bidirectional arrayed genetic screens identify OXR1 and EMC4 as modifiers of αSynuclein aggregation

在帕金森病等突触核蛋白病中，α-突触核蛋白(αSyn)的错误折叠与聚集是核心病理事件，但其调控因子尚不明确。为此，研究人员利用阵列式CRISPR激活与敲除技术，在HEK293细胞模型中开展了大规模遗传筛选，成功鉴定出线粒体蛋白OXR1和内质网膜蛋白EMC4是调控αSyn磷酸化聚集(pSyn129)的关键因子。该研究不仅拓宽了对突触核蛋白病发病机制的理解，也为潜在的治疗干预提供了新的靶点。

　　

在人类大脑的深处，一种名为α-突触核蛋白（α-synuclein, αSyn）的小分子蛋白质，通常在大脑的突触部位默默无闻地工作，负责调控神经递质的释放。然而，在某些情况下，这种原本功能正常的蛋白质会发生“叛变”，错误地折叠、聚集，最终形成一种名为路易体的有毒团块。这一过程是帕金森病（Parkinson's disease, PD）、路易体痴呆（Dementia with Lewy Bodies, DLB）和多系统萎缩（Multiple System Atrophy, MSA）等一系列神经退行性疾病——统称为突触核蛋白病（synucleinopathies）——的共同病理标志。这些疾病影响着全球数千万人，随着人口老龄化，其发病率仍在不断攀升。尽管科学家们已知道αSyn的聚集是罪魁祸首，但究竟是哪些细胞内的“开关”和“信号”在控制着这一有害的聚集过程，仍然迷雾重重。这极大地限制了我们开发有效治疗手段的能力。

为了拨开这层迷雾，一支研究团队在《FEBS Open Bio》杂志上发表了一项突破性的研究。他们设计并执行了一项前所未有的大规模、双向遗传筛选实验，旨在系统性地发现那些能够增强或抑制αSyn聚集的关键基因。研究团队巧妙地利用了前沿的CRISPR基因编辑技术，构建了两个互补的细胞模型：一个可以通过CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）技术“打开”特定基因的表达；另一个则可以通过CRISPR敲除（CRISPR ablation, CRISPRo）技术“关闭”特定基因。他们将目光聚焦于与线粒体功能、细胞内运输（ trafficking ）和细胞运动性（ motility ）相关的数千个人类基因，怀疑这些细胞器的功能紊乱与αSyn的病理聚集密切相关。

研究人员首先在稳定表达人源野生型αSyn的HEK293细胞（HEK^Syn）中建立了高通量筛选平台。他们用体外制备的αSyn预制原纤维（pre-formed fibrils, PFFs）处理细胞，以此“播种”并诱导细胞内αSyn的聚集。随后，他们通过高内涵荧光显微镜自动捕捉细胞图像，并利用一种特定的抗体（识别αSyn在丝氨酸129位点被磷酸化的形式，即pSyn¹²⁹）作为聚集的标志物进行定量分析。整个筛选过程高度自动化且可重复，确保了数据的可靠性。

通过这场大规模的“基因猎寻”，研究团队从超过4700个基因中成功筛选出了数十个能显著改变pSyn¹²⁹聚集水平的候选基因。经过严格的二次验证，两个表现最突出、效应最稳健的基因脱颖而出：氧化抗性基因1（Oxidation Resistance Gene 1, OXR1）和内质网膜蛋白复合体亚基4（ER Membrane Protein Complex Subunit 4, EMC4）。

令人惊讶的是，这两个基因对αSyn聚集产生了截然相反的影响。当研究团队通过CRISPRa技术激活OXR1基因（即人为提高其表达量）时，细胞内的pSyn¹²⁹聚集显著增加。相反，当他们利用CRISPRo技术敲低EMC4基因的表达时，pSyn¹²⁹的聚集水平则明显下降。重要的是，这些操作并未影响细胞的基本活力，说明观察到的效应是特异的，而非细胞死亡的副产品。

这两个基因为何有如此威力？研究团队紧接着深入探索了它们背后的作用机制。

对于OXR1，这个主要位于线粒体的蛋白，已知功能是抵抗氧化应激。转录组测序（RNA sequencing）分析发现，激活OXR1会引发细胞内基因表达的广泛重编程。特别值得注意的是，一系列与线粒体ATP合成（细胞的“能量货币”生产）相关的基因被显著抑制。功能实验证实，OXR1的过度激活确实导致了细胞内ATP水平的下降，并对线粒体膜电位产生了轻微但可检测的影响。这表明，OXR1可能通过干扰线粒体的能量代谢，创造了一个有利于αSyn聚集的细胞内环境。更有趣的是，研究还发现OXR1的激活会上调纤维调节蛋白（Fibromodulin, FMOD）和趋化因子CCL8等基因，而下调醛缩酶C（Aldolase C, ALDOC）等基因。当单独操纵这些下游基因时，它们也能重现OXR1激活的效果——促进pSyn¹²⁹聚集，这勾勒出了一条由OXR1主导的、复杂的促聚集信号网络。

对于EMC4，它是内质网膜蛋白复合体（ER Membrane Protein Complex, EMC）的一个组成部分，该复合体参与内质网相关的蛋白质质量控制和膜蛋白插入。机制探究揭示了另一番景象。敲低EMC4后，转录组分析显示与溶酶体（细胞的“回收站”）功能相关的通路被显著激活。研究人员推测，EMC4的减少可能增强了细胞通过溶酶体途径清除错误折叠蛋白（包括αSyn聚集体）的能力。为了验证这一点，他们使用了溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1, BafA1）。实验发现，在EMC4敲低的细胞中，BafA1处理能够有效地逆转pSyn¹²⁹水平的下降。与此同时，自噬标志物p62的积累减少和LC3B-II的增加，进一步证实了自噬流（autophagic flux）的增强。这些证据有力地表明，EMC4的缺失是通过增强自噬-溶酶体降解途径，从而加速了αSyn聚集体的清除。相反，抑制蛋白酶体（另一种蛋白质降解途径）则不能逆转EMC4敲低带来的保护效应，说明该效应具有通路特异性。

为了确认这些在HEK293细胞中的发现在更接近人类疾病的模型中是否依然成立，研究团队将战场转移到了由人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, iPSCs）分化而来的神经元。他们分别培养了皮质神经元和更贴近帕金森病病理的多巴胺能神经元。在这些珍贵的神经元模型中，重复了OXR1激活和EMC4敲低的实验。

结果令人振奋。在iPSC衍生的皮质神经元中，激活OXR1同样导致了神经元胞体和神经突触中pSyn¹²⁹聚集的增加。而在iPSC衍生的多巴胺能神经元中，OXR1的激活也显著增加了酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxidase, TH）阳性（即多巴胺能）神经元内的pSyn¹²⁹负荷。这完美地验证了OXR1在疾病相关神经元类型中的促聚集作用。另一方面，在皮质神经元中利用短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）敲低EMC4，也成功再现了降低pSyn¹²⁹聚集的表型，证明了该靶点在神经元环境中的普适性和治疗潜力。

此外，研究还探讨了这两种调控因子对不同“菌株”的αSyn聚集体的影响。他们使用了来自帕金森病、路易体痴呆和多系统萎缩患者的脑源性αSyn原纤维，以及实验室制备的不同结构形态的原纤维。结果显示，OXR1的激活对多系统萎缩来源的菌株影响尤为显著，而EMC4的敲低则能广泛降低多种不同来源αSyn菌株诱导的聚集，提示EMC4可能是一个更广谱的调控节点。

综上所述，这项研究通过开创性的双向CRISPR筛选平台，成功绘制了调控αSyn病理聚集的遗传图谱，并首次将OXR1和EMC4这两个蛋白确立为该过程中的核心调控因子。研究表明，OXR1可能通过损害线粒体能量代谢促进聚集，而EMC4则通过抑制自噬-溶酶体清除途径来维持聚集体的稳定。这一发现具有多重重要意义：首先，它极大地丰富了我们对突触核蛋白病分子机制的理解，揭示了线粒体功能紊乱与内质网-溶酶体降解通路之间的复杂相互作用在疾病发生中的关键角色。其次，OXR1和EMC4作为全新的潜在治疗靶点，为开发帕金森病等神经退行性疾病的药物开辟了新的方向。例如，抑制OXR1的功能或增强EMC4的活性（或补偿其功能），可能成为减缓甚至阻止αSyn有毒聚集的有效策略。最后，研究所建立的高通量、多组学验证的研究范式，也为系统性地研究其他蛋白质错误折叠疾病的遗传基础提供了强大的方法学工具。这项研究如同在神经退行性疾病的黑暗迷宫中点亮了两盏新的明灯，照亮了通往理解与治疗这些顽疾的潜在路径。