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近年来，利用Cas9、Cas12和Cas13酶（CRISPR–Cas）的核酸检测方法已广泛地与等温扩增技术，特别是环介导等温扩LAMP）相结合，用于开发针对多种病原体的基于CRISPR的诊断方法。将这些系统与侧向流动层析（LFA）、微流控和智能手机等便携式结果
近年来，利用Cas9、Cas12和Cas13酶（CRISPR–Cas）的核酸检测方法已广泛地与等温扩增技术，特别是环介导等温扩LAMP）相结合，用于开发针对多种病原体的基于CRISPR的诊断方法。将这些系统与侧向流动层析（LFA）、微流控和智能手机等便携式结果读出平台相结合，为在资源有限地区（如即时检测）部署LAMP–CRISPR诊断提供了一条有前景的途径，尤其是在实时聚合酶链式反应（PCR）等传统的、资源密集型方法不可行的情况下。然而，LAMP–CRISPR检测方法的开发带来了实时PCR工作流程中通常不会遇到的独特挑战，包括需要设计更多寡核苷酸、整合多种生化条件的复杂性以及假阳性结果风险的增加。尽管旨在帮助检测方法开发的生物信息学工具数量日益增长，但建立稳健且可重复的LAMP–CRISPR工作流程仍然是一个重大障碍。在这篇综述中，研究人员批判性地审视了当前设计LAMP–CRISPR检测方法的策略，并提供了一个详细的、逐步的指南，以指导使用该方法开发高性能诊断工具。研究人员涵盖了靶标序列选择、寡核苷酸和CRISPR系统设计以及读出方法战略选择的关键方面。研究人员进一步讨论了可用于LAMP引物和CRISPR向导RNA（gRNA）设计的现有工具，并为优化序列选择提供了实用建议。研究人员总结了用于Cas介导的反式切割检测的各种探针形式，并提出了检测方法标准化和最小化假阳性信号的最佳实践。最后，研究人员强调了LAMP–CRISPR诊断在分散式和现场检测环境中的当前局限性，并概述了未来的发展方向。
一、研究背景、现存问题与研究目的
传染性疾病对全球公共卫生和经济构成重大威胁，其快速传播特性在全球化背景下尤为突出。早期、灵敏且特异的诊断是指导有效治疗、监测和控制感染传播及耐药微生物进化的关键。目前，聚合酶链式反应（PCR）因其高灵敏度、特异性、自动化能力和易实施性，被认为是诊断多种感染的“金标准”。然而，PCR对仪器、实验室条件和专业人员的依赖，使其难以满足偏远、资源有限地区或大规模疫情期间的检测需求。因此，需要开发更简单、快速、廉价但能保持准确性的即时检测（PoC）替代方案。
在众多等温核酸扩增技术（iNAATs）中，环介导等温扩增（LAMP）因其能使用相对较少的酶组分扩增DNA和RNA靶标、试剂易得、标准化协议成熟、扩增速度快、灵敏度高且对抑制物耐受性好，成为诊断应用中极具前景的方法。然而，LAMP也存在挑战，如其高灵敏度的特性（高引物浓度和广泛的自引发）也增加了非特异性扩增的易感性，可能导致假阳性结果。为提高特异性，将LAMP与基于CRISPR–Cas系统的序列依赖性检测工具相结合，成为一条有效途径。CRISPR–Cas系统，特别是具有反式切割活性的Cas12、Cas13和Cas14（现称Cas12f），可实现高特异性靶标识别和信号放大。但开发LAMP–CRISPR检测面临独特困难，包括需要设计更多寡核苷酸、整合多种反应条件、假阳性风险高，且尽管有生物信息学工具辅助，建立稳健、可重复的工作流程仍是一大障碍。本综述旨在批判性地审视当前LAMP–CRISPR检测设计策略，并提供详尽的逐步指南，以助力开发高性能诊断工具，并讨论其局限性和未来方向。该文发表在《Methods》期刊。
二、关键技术方法
- 1.
文献综述与系统化设计框架构建：研究人员对LAMP–CRISPR诊断领域的现有研究和策略进行了系统性梳理，整合了从目标序列选择、引物与gRNA设计、CRISPR/Cas系统选择、检测读出策略到反应条件标准化及验证的完整工作流程，形成了一幅详细的路线图（如图2所示），为后续分析提供了结构框架。
- 2.
生物信息学工具的应用与分析：研究人员详尽汇总和比较了用于LAMP引物设计（如NEB LAMP Primer Design Tool, Primer Explorer, GLAPD等）和CRISPR gRNA设计（如CRISPick, CHOPCHOP, CaSilico, PrimedSherlock等）的多种生物信息学工具。通过对这些工具的可用性、支持酶类型、输入格式、参考基因组选项、PAM序列兼容性、脱靶分析功能、优缺点等进行列表对比分析，为研究人员根据具体需求选择合适工具提供了实践指导。
- 3.
CRISPR/Cas系统特性比较与选择策略：研究人员列表（表1）对比了Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14/Cas12f等多种Cas蛋白在诊断应用中的关键特性，包括靶分子类型、gRNA长度、PAM序列、优缺点等。结合示意图（图3）展示不同Cas酶的功能特征，为根据不同检测目标（如DNA/RNA、SNP检测、是否需要逆转录、是否追求“一锅法”等）选择最适CRISPR/Cas系统提供了依据。
- 4.
检测读出策略的归纳与评估：研究人员总结了LAMP–CRISPR检测的多种结果读出方法，包括荧光检测（可结合智能手机）、比色法、侧向流动层析、电化学检测、微流控以及多信号模式等。通过引用具体研究实例（如图4所示），分析了各种方法的原理、灵敏度、特异性、设备依赖性、成本及在PoC场景下的适用性，为检测方法开发中的读出平台选择提供了参考。
三、研究结果与结论
2. LAMP-CRISPR设计概览
LAMP–CRISPR检测的通用工作流程通常分四步：靶标序列定义、检测方法设计（序列和酶的定义）、反应条件标准化、检测方法验证。反应通常顺序进行，先进行LAMP扩增，再将部分扩增产物转移至包含Cas酶、gRNA和报告分子的CRISPR检测反应中。
2.1. 靶标选择策略
靶标选择是保证灵敏度和特异性的关键。通常应选择高度保守的基因或区域。对于具有高突变率的生物（如RNA病毒），可能需要持续更新寡核苷酸序列。对于基因分型或单核苷酸多态性（SNP）检测，则需要更精确的设计。多重检测可用于识别单一生物的不同变体或对症状相似的疾病进行鉴别诊断。在多重检测中，策略包括将LAMP产物加入不同管的CRISPR系统、“一锅法”利用不同Cas酶的切割偏好、试剂封装或与微流控设备集成。无论目标如何，建议选择一组有潜力的基因作为候选靶标，因为所选序列必须同时与LAMP引物和CRISPR–Cas复合物的gRNA互补，并包含与酶特异性PAM区域互补的序列。有研究将PAM序列甚至crRNA识别序列人工插入LAMP引物中以方便靶标选择。
2.2. CRISPR/Cas系统的选择
选择合适的CRISPR–Cas系统至关重要。Cas9传统上被认为缺乏反式切割活性，但在特定条件下也可能表现出此活性，其更常以切口酶或失活形式用于结合检测而非切割。Cas12a是目前研究和商业化检测中最常用的系统之一，因其可用性、标准化程度高且gRNA较短。Cas12b存在耐热直系同源物，可用于“一锅法”检测。Cas13可被ssRNA激活并切割ssRNA，需要额外的转录步骤，但存在耐热直系同源物，可用于快速反应和SNP检测。Cas14/Cas12f可被ssDNA激活且无需PAM识别，设计更简单，也可用于SNP检测。gRNA设计工具的可用性也是选择酶的因素之一，大多数工具为Cas9和Cas12a开发。设计时需特别注意避免gRNA序列与任何LAMP引物重叠。
2.3. 检测读出策略
LAMP–CRISPR检测结果可通过多种策略读出，无需实时定量。荧光检测灵敏度、特异性高，但通常需要荧光读取设备，可与智能手机结合用于PoC。比色法（如pH敏感染料）依赖可见颜色变化，易于解释且无需复杂仪器，适合PoC和大规模筛查。侧向流动层析（LFA）通过条带上显色模式判断结果，简单、廉价，适合现场应用。电化学生物传感器通过电极上氧化还原标记的寡核苷酸被切割产生的电信号变化进行检测，更经济、便携。微流控技术可将多个步骤集成到芯片上，减少试剂、自动化、最小化污染风险，与LAMP–CRISPR结合可实现快速、精确的PoC诊断。此外，还存在结合多种信号模式（如荧光和比色）的多信号检测方法。智能手机因其摄像头和应用程序，可用于捕获和分析LFA或荧光图像，实现远程诊断，在资源有限地区尤有价值。
3. LAMP检测的设计策略
3.1. LAMP引物结构与设计参数
LAMP引物的正确设计对形成哑铃状结构和实现特异性扩增至关重要。LAMP引物包括内部引物（FIP和BIP，约45-49 bp，含4个胸腺嘧啶间隔）、外部引物（F3和B3，21-24 bp）以及可选的环引物（LB和LF）。良好的引物组应具有平衡的GC含量、相似Tm、最小的自身互补性和适当的靶区间距。设计不佳的引物会导致特异性降低、检出限变差或性能受突变影响。引物设计需考虑目标区域变异性、允许的错配、Tm、GC含量、ΔG、引物间距等多种因素。环引物的加入可提高检测速度和灵敏度。
3.2. 生物信息学工具
由于LAMP需要更多引物，其设计比PCR更复杂。多种生物信息学工具可用于辅助设计，包括免费的在线工具（如NEB LAMP Primer Design Tool, Primer Explorer）和更高级的工具（如GLAPD, LAMPrimers iQ, Premier Biosoft LAMP Designer）。这些工具在输入序列长度、二聚体形成检查、特异性检查、额外功能（如多重设计、RNA模板支持）等方面各有特点和限制。设计时需根据项目需求选择合适的工具，有时需使用多个平台。建议合成和测试多组引物。设计完成后，可使用Oligo 7等工具进行二级结构和引物二聚体检测。
4. 合成CRISPR向导RNA的设计
4.1. 向导RNA识别与PAM要求
将CRISPR–Cas系统与LAMP整合可通过序列依赖性检测增强特异性。这通过设计靶向并触发Cas核酸酶切割LAMP扩增产物的向导RNA（gRNA）实现。切割通常取决于原间隔序列邻近基序（PAM）序列的存在，其因所用的Cas蛋白而异。有研究将Cas12a的PAM识别位点和gRNA靶位点人工嵌入FIP引物中，以方便设计，但需额外注意避免序列重叠和假阳性风险。
4.2. gRNA设计工具与脱靶预测
目前尚无同时设计LAMP引物和gRNA的统一工具，需依赖独立的软件工具。大多数gRNA设计工具最初为基因组编辑开发，参考基因组和PAM序列选择有限。尽管如此，CRISPick、Cas Designer、CHOPCHOP、CRISPOR等平台支持Cas12的gRNA设计。最近推出的工具如CaSilico和PrimedSherlock专门针对病原体诊断，更为灵活。由于较长序列增加假阳性可能性，LAMP–CRISPR诊断中通常首选Cas12a。无论使用何种工具，进行脱靶分析至关重要，可使用Cas-OFFinder等专用工具。gRNA设计也需考虑靶序列的GC含量、二级结构、同源性和连续碱基重复等因素。与LAMP引物设计一样，建议设计并测试多个gRNA。
四、讨论与总结
讨论部分总结：研究人员在文中详细讨论了LAMP–CRISPR检测开发中各个环节的考量、策略、可用工具及最佳实践，并指出了当前存在的挑战和未来的发展方向。尽管LAMP–CRISPR在PoC诊断中展现出巨大潜力，但其从研究到临床实践的转化仍不均衡，受监管途径、现有诊断基础设施和市场动态影响。开发过程比PCR更复杂，需要精心设计更多寡核苷酸并整合具有不同反应条件要求的两个系统。假阳性风险是需要特别关注和通过设计优化、条件标准化来最小化的问题。生物信息学工具的不断发展为设计提供了重要支持，但选择合适的工具并理解其输出仍需研究者专业知识。未来方向包括开发更稳健的“一锅法”检测、优化热稳定性Cas酶、改进多重检测策略、与便携式/智能手机集成读出平台深度融合，以及应对高突变率病原体和推进监管批准。
研究结论翻译：LAMP与CRISPR–Cas系统的整合为开发灵敏、特异且适用于资源有限环境的分子诊断工具提供了一个强大的平台。本综述提供了设计稳健LAMP–CRISPR检测的详细路线图，涵盖了从靶标选择到最终验证的关键步骤。通过遵循所概述的原则并利用现有的生物信息学工具，研究人员可以克服固有的挑战，并开发出能够在分散式和即时检测环境中产生变革性影响的诊断方法。
