《Biodiversity and Conservation》：DNA barcoding reveals taxonomic uncertainties and cryptic lineages of fish from the Mearim River basin, Maranh?o, Brazil
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梅阿林河位于巴西东北部，构成一个具有重要社会经济和生态价值的流域，其鱼类物种多样性高，包含多个特有种。然而，在该流域开展的大多数研究主要集中于分类调查和物种编目。因此，关于构成其鱼类区系的物种的遗传特征认知仍然有限。为解决这一知识缺口，本研究利用DNA条形码技
梅阿林河位于巴西东北部，构成一个具有重要社会经济和生态价值的流域，其鱼类物种多样性高，包含多个特有种。然而，在该流域开展的大多数研究主要集中于分类调查和物种编目。因此，关于构成其鱼类区系的物种的遗传特征认知仍然有限。为解决这一知识缺口，本研究利用DNA条形码技术，对梅阿林河及其支流的鱼类多样性进行分子鉴定和特征分析。在2014年至2020年间，研究人员平均每轮次进行了约20次调查，共捕获2,412个个体。通过对线粒体细胞色素c氧化酶亚基I (COI) 基因的640 bp (碱基对) 片段进行测序，共获得914条序列，对应74个物种、67个属、33个科和10个目。分子物种界定分析恢复出74至77个操作分类单元 (OTU)。根据自动条形码间隙发现 (ABGD)、基于自动划分组装物种 (ASAP)、广义混合溯祖与种化 (GMYC) 和贝叶斯泊松树过程 (bPTP) 模型的分析结果，相比基于形态学标准确定的物种数量，分子实体数量有所增加，表明存在隐存多样性和潜在的鉴定错误。相反，ABGD方法恢复的分子实体数量与基于形态学标准界定的总物种数相当。本研究的结果显著填补了该流域物种遗传多样性的知识空白，为制定区域渔业资源管理和保护策略提供了支持。
鱼类是脊椎动物中最为多样化的类群，近年来，不断有新物种被鉴定和描述，从而提高了对新热带淡水鱼类区系多样性的估计。尽管巴西鱼类多样性的研究仍在进行中，但显然我们远未完全理解这一类群。巴西拥有南美洲最丰富的淡水鱼类多样性，约占新热带区鱼类区系的50%；然而，考虑到无数物种仍未被描述或科学界对其知之甚少，这一数字可能仍被低估。在巴西，马拉尼昂州以其广泛而复杂的水文网络而著称，该网络由长年河流和多样化的湖泊系统组成。此外，该州位于一个过渡地带，涵盖了亚马逊和塞拉多两个重要的国家生物群落，这两个生物群落支持着新热带鱼类的高度多样性和异质性。在马拉尼昂州，梅阿林河流域覆盖面积达98,289.05平方公里，占该州领土的29.6%。其主要支流包括右岸的科尔达河和弗洛雷斯河，以及左岸的平达雷河和格拉雅乌河。该流域的水资源在区域发展中发挥着重要作用，广泛用于城市和工业公共供水、农业灌溉、养殖活动和水产养殖企业。尽管梅阿林河流域仍拥有显著的水资源可利用性，但环境退化过程日益加剧，例如河床及其支流淤积、水源退化、河岸森林破坏以及水质变化。这些影响主要与森林砍伐、焚烧和废水排放有关，对河流系统的生态完整性造成巨大压力。梅阿林河流域鱼类区系的知识通过2005年至2023年间开展的研究得到扩展，然而，这些研究大多侧重于采用分类学和谱系地理学方法对样本进行分析。尽管取得了这些进展，但仍有若干物种的分类地位不确定，且大量样本未被鉴定到种级水平，这表明该地区的分类丰富度可能被低估。该流域的首次分类调查记录了60种鱼类。随后，基于对科学馆藏标本的分析和专业文献数据的汇编，物种数量增至100种。在平达雷河进行的一项编目研究中，鉴定出101种鱼类。随后，研究人员为梅阿林河流域报告了130个物种。在一项后续研究中，为平达雷河编目了102种鱼类。在最近的研究中，基于对科学馆藏中凭证标本的鉴定，在马兰哈昂低地排水的河流中记录了100种鱼类。关于该地区鱼类遗传多样性的研究，研究人员利用DNA条形码技术，在弗洛雷斯河和格拉雅乌河记录了26个物种的发生，包括特有种和遗传上独特的谱系。这些研究强调了进行更详细研究的必要性，特别是分类学、形态学、分子和生态学研究，以更好地表征栖息于该地区的鱼类多样性。
传统分类学，基于形态学特征的分析，仍在物种界定和鉴定中被广泛使用。然而，当应用于鱼类等复杂类群时，由于高表型可塑性和隐存种 (cryptic species) 的存在，这种方法存在显著局限性，可能导致错误鉴定。作为克服经典分类学局限性的策略，DNA条形码 (DNA barcoding) 倡议启动，旨在为脊椎动物和无脊椎动物物种提供可靠的分子鉴定系统。自2003年以来，DNA条形码已成为普遍接受的物种鉴定工具，它解决了分类学上的模糊性，并有助于发现新种或隐存种。在近几十年，分子生物学技术，特别是线粒体细胞色素c氧化酶亚基I (COI) 基因的使用，因其速度和成本效益而被证明非常有效。
本研究旨在利用DNA条形码技术从分子层面鉴定梅阿林河流域鱼类区系的多样性。其主要贡献是创建了该地区有史以来最全面的分子数据库。该DNA条形码库的构建对未来的研究具有里程碑意义，因为生成的序列将作为研究工具，协助该河流流域鱼类多样性的监测和保护。
研究区域涵盖亚马逊和塞拉多生物群落，属于炎热半湿润的热带气候，雨季（1月至6月）和旱季（7月至12月）分明。梅阿林河全长约742公里，发源于塞拉达梅尼纳山坡的福莫萨达塞拉内格拉市，注入圣马科斯湾。该河系分为上、中、下游三段。上梅阿林河从源头延伸至弗洛雷斯河大坝，全长304.9公里。该地区地形崎岖，多急流。中梅阿林河包括从弗洛雷斯河口到塞科达拉斯马斯的河段，全长156.7公里，其特点是河道展宽、冲积物显著沉积以及平均深度减小。下梅阿林河从塞科达拉斯马斯延伸至河口，覆盖约280.4公里，特点是水流减缓、河岸展宽并受海洋影响。靠近河口处，格拉雅乌河和平达雷河流入其中，其洪泛平原属于马兰哈昂低地湖泊群的一部分。
采样在平达雷河、格拉雅乌河、弗洛雷斯河、科尔达河以及梅阿林河的三段进行，共涵盖皮尔、佩纳尔瓦、格拉雅乌、若泽兰迪亚、维多利亚杜梅阿林、拉日斯杜库拉尔、佩德雷拉斯和科尔达巴拉等市镇。在2014年至2020年间，研究人员平均每轮次进行了约20次调查，每次持续三天。生物样本的采集由奇科·门德斯生物多样性保护研究所（ICMBio）授权。采集在沿河九个点进行，共捕获2,412个个体。使用拖网和多种网目尺寸（15-35毫米）的刺网进行收集。收集到的标本通过浸泡在冰水中处死，放入塑料袋，置于冰上运送至马兰哈昂州立大学卡西亚斯校区分子生物学实验室。抵达后，对标本进行标记、拍照，并取肌肉组织样本。这些组织保存在80%乙醇中，并储存在-20°C。随后，标本在10%福尔马林中固定，然后保存在70%乙醇中，最后送至伦德里纳州立大学动物学博物馆（MZUEL）进行形态学鉴定、编目和凭证标本的馆藏。
使用Promega公司的Wizard基因组DNA纯化试剂盒从肌肉组织中提取总DNA。目标区域的COI基因通过聚合酶链式反应（PCR）扩增，使用特异性引物。PCR产物使用ExoSap-IT试剂盒纯化，随后基于桑格法进行DNA测序。PCR产物在ABI Prism? 3500自动DNA测序仪上测序。
DNA序列使用BioEdit 7.2.6.1软件中的Clustal W算法进行分析、验证、比对和手动编辑。生成的序列已存入GenBank和BOLD Systems数据库。为了评估序列相似度，使用BOLD Systems平台和BLAST工具对获得的序列进行比较。遗传距离估计在MEGA X软件中使用木村双参数（K2P）模型生成。
操作分类单元（OTU）界定采用了多种方法：自动条形码间隙发现（ABGD）、基于自动划分组装物种（ASAP）、泊松树过程（PTP）和广义混合溯祖与种化（GMYC）。ABGD分析在网络服务器上使用比对后的序列进行。ASAP分析在网站上进行，使用在MEGA X中生成的遗传距离矩阵。PTP分析在网络服务器上进行，使用在RAxML中构建的最大似然树作为输入。GMYC分析基于在BEAST中生成的超度量贝叶斯树，并在R软件中使用相关包进行。使用jModelTest为贝叶斯推断（BI）分析选择最佳核苷酸替换模型。BI分析在BEAST中使用广义时间可逆模型（GTR+G+I）进行，分析运行4000万代。收敛性和有效样本量在Tracer中检查，并应用适当的退火期。使用TreeAnnotator生成共识树，并在FigTree和Inkscape中可视化和编辑。后验概率（PP）值≥0.95的分支被视为强烈支持。
本研究共获得914条线粒体COI基因640 bp片段的序列，对应74种、67属、33科和10目鱼类。在鉴定出的物种中，鲶形目（Siluriformes）占主导地位，包含30种（41%），其次是脂鲤目（Characiformes），有24种（32%）。在科级水平上，甲鲶科（Loricariidae）最具代表性，有9种（12%），其次是长臀鲶科（Auchenipteridae），有7种（9%）。在属级水平上，*Ageneiosus*属物种数量最多，有3种（4%），而*Pimelodella*、*Pimelodus*、*Cichla*和*Potamotrygon*属各有2种（3%）。
在分析的物种中，一些分类群在形态学和分子学鉴定之间存在差异。例如，*Prochilodus lacustris*与*P. nigricans*显示出超过97%的相似性。类似的情况也见于*Leporinus piau*，它与多个同属物种显示出显著的分子匹配。分类群*Bryconops* sp.、*Sturisoma* sp.和*Cichla* sp.在分子上分别被鉴定为*Bryconops affinis*、*Sturisoma robustum*和*Cichla monoculus*。此外，物种*Cichlasoma zarskei*、*Saxatilia brasiliensis*、*Hemiodus parnaguae*和*Rhamphichthys pantherinus*在分子鉴定上存在分歧，在本研究中分别被鉴定为*Cichlasoma orientale*、*Crenicichla menezesi*、*Hemiodus argenteus*和*Rhamphichthys marmoratus*。
检测到较低的种内遗传分化水平，平均为0.2%，最高值出现在*Pimelodella cristata*（4%）。属内平均遗传距离为3%，科内平均为4.2%。在目级水平上，平均遗传分歧为9.6%。
使用形态学标准鉴定出74个物种，而使用ASAP、ABGD、GMYC和bPTP方法分别恢复出76、74、77和76个操作分类单元（OTU）。分类群*Schizodon dissimilis*、*Moenkhausia dichroura*、*Hoplias malabaricus*、*Loricaria cataphracta*和*Pseudoplatystoma punctifer*被至少一种分子方法视为两个实体。在*Leporinus piau*的界定上，四种方法达成共识，将其归为两个不同的分子实体。对于*Pimelodella cristata*也观察到类似结果。对于物种*Potamotrygon motoro*和*P. orbignyi*，形态学鉴定与分子方法之间存在不一致，因为这些物种被合并为一个分子实体。
与之前在梅阿林河流域支流进行的研究相比，本研究记录了74个物种，占所分析分类群的93%，这一数量显著高于前人报告的结果。这些结果凸显了DNA条形码作为物种鉴定有效工具的潜力。考虑到所得数据的代表性，本研究是迄今为止该地区最全面的调查，整合了形态学和分子学证据来界定和验证物种。此外，本研究还贡献了参考序列，扩展了GenBank和BOLD等公共平台上的可用数据集。研究结果揭示了之前形态学鉴定与*P. lacustris*的分子数据之间的差异，后者与*P. nigricans*显示出显著的匹配性。研究人员假设，沉积在比较平台上的序列被错误地标记为*P. nigricans*，而实际上可能对应于*P. lacustris*。这种错误标记可能是由于仅依靠形态特征难以准确鉴定这些物种所致。事实上，缺乏可靠的诊断解剖特征在这一属的代表类群中是众所周知的，这会导致鉴定错误。因此，重新检查与*Prochilodus*序列相关的凭证标本以确认其分类身份将是有价值的。
关于*Loricaria cataphracta*，本研究结果表明梅阿林河流域发生的物种是*S. robustum*，而非*S. barbatum*。尽管之前有报道称该流域存在*S. rostratum*，但本研究基于比较分析获得的证据表明，该记录实际上对应于*S. robustum*，对先前发表的鉴定提出了质疑。观察到的分类混淆可能源于传统上使用的形态特征在相似同属物种之间存在广泛重叠。
物种*Cichlasoma zarskei*、*Saxatilia brasiliensis*、*Hemiodus parnaguae*和*Rhamphichthys pantherinus*在分子鉴定上存在不一致，分别被归为*C. orientale*、*C. menezesi*、*H. argenteus*和*R. marmoratus*。这种差异可能与最近的分类修订有关，这些修订导致了这些分类群的具体界定和有效命名法发生变化。然而，用于序列比较的分子参考数据库尚未反映这些分类更新，这可能导致遗传相似性分析中出现不一致或过时的分配。
平均种内遗传距离显著低于种间距离，显示出所分析分类群之间存在一致的分子区分模式。这些结果证实了淡水鱼类区系中先前的研究发现，即物种内的遗传分歧低于不同物种之间记录到的分歧。可以验证，随着分类等级层次的增加，遗传相似性逐渐降低，而更高级别的分类单元之间的遗传距离则增加。在分析的物种中，*Pimelodella cristata*显示出最大的种内遗传分歧（4%），这可能表明该类群中存在被忽视的分类群。事实上，文献记录了该属中显著遗传分歧的反复案例，这应与隐存种化 (cryptic speciation)、物种复合体的存在、新分类群的最近描述和/或种群结构化有关。系统发育分析表明，*P. cristata*的一些代表与*P. parnaybae*聚类，并且在比较平台上与该物种显示出高度相似性。这一结果表明可能存在错误的分类鉴定，而不是反映了高种内分歧。
在所采用的界定方法中，贝叶斯泊松树过程（bPTP）模型在区分形态学定义的物种方面表现最为敏感。总体而言，bPTP和GMYC模型显示出高度一致性，产生了相似的OTU聚类。主要的差异见于*Schizodon dissimilis*，该物种被GMYC模型界定为两个OTU，表明可能存在种内细分。对于*Loricaria cataphracta*，两种界定模型也识别出两个OTU。仅GMYC和bPTP模型将*Hoplias malabaricus*界定为两个OTU。这些结果与先前显示该物种具有高遗传变异性的研究一致，并且表明在马拉尼昂州的流域中至少存在三个不同的谱系。所有界定模型都确认*Leporinus piau*存在两个OTU。
鉴于本研究获得的结果，提出了以下未来研究问题：（1）本研究中指出的可能错误鉴定情况的真实分类地位是什么？（2）有哪些形态特征可用于鉴定和/或描述这些物种？（3）其他分子标记的使用能否证实本研究获得的结果？（4）哪种分子标记最合适？
通过整合经典分类学和DNA条形码技术，研究人员得以指出鉴定问题并揭示梅阿林河流域的隐存多样性。本研究的结果显著填补了关于该流域先前未知物种遗传多样性的知识空白。此处提出的证据强调了在分类学和分子学研究中采用整合方法的重要性，并为制定区域渔业资源管理和保护策略提供了支持。
