《Process Biochemistry》：AI-Assisted bioprocessing for sewage wastewater treatment using cyanobacteria-graphene nanohybrid for exploring anti-oxidant analysis and their impact on seed germination of Vigna radiata
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胺修饰石墨烯（AF-G）与蓝藻Synechocystis sp. SS123_AK协同处理生活污水，显著提升总氮、总磷、总有机碳和化学需氧量去除效率（25ppm AF-G达95.07%-98.46%），同时促进生物质与高价值多不饱和脂肪酸脂质（如C18:3、22:6）生产，并通过AI模型验证其高效预测藻类生长光学密度的能力，处理水可灌溉菜豆种子。
安韦莎·德伊（Anwesha Dey）、普林斯·贾因（Prince Jain）、朱希·萨克塞纳（Juhi Saxena）、德里希亚·普拉卡尚（Drishya Prakashan）、安舒·库马尔（Anshu Kumar）、阿努帕姆·乔蒂（Anupam Jyoti）、贾伊维克·帕塔克（Jaivik Pathak）、乌纳蒂·乔希（Unnati Joshi）、沙基尔·艾哈迈德·汗（Shakeel Ahmad Khan）、索努·甘地（Sonu Gandhi）
印度古吉拉特邦瓦多达拉市帕鲁尔大学（Parul University）帕鲁尔理工学院（Parul Institute of Technology）生物技术系，邮编391760
摘要
胺功能化石墨烯（AF-G）的出现显示出巨大的潜力，不仅可以增强蓝细菌的光合作用，还能从废水中去除有毒物质，并产生高价值的代谢物。本研究探讨了AF-G与蓝细菌Synechocystis sp. SS123_AK之间的协同效应，以提高营养物质去除率以及生物量和脂质的产量。在10天后，25 ppm的AF-G分别实现了总氮、总磷、总有机碳和化学需氧量的95.07%、93.24%、97.67%和98.46%，同时生物量和脂质也有所增加。这一结果优于原始石墨烯（P-G），因为在处理前，污水中的总氮（TN）、总磷（TP）、总有机碳（TOC）和化学需氧量（COD）的初始浓度分别为164.01 mg/L、180.36 mg/L、351.39 mg/L和405.6 mg/L。通过多种基于回归的机器学习模型预测了使用AF-G和P-G培养的蓝细菌的光学密度，其中堆叠集成模型表现最佳，其R2值为0.9839，均方误差（MAE）较低，证明了其在生物量估计方面的强大预测能力。脂质分析显示，PUFA（如C18:3、22:5、22:6等）的产量较高，其次是MUFA和SFA。进一步评估了这些脂质在E. coli和S. aureus刺激下的人体中性粒细胞中的抗氧化潜力。此外，处理后的水还可用于Vigna radiata种子的灌溉，展示了其在农业中的应用潜力。
引言
水是一种关键的自然资源，全球水资源短缺已成为环境可持续性和公共卫生的紧迫问题[1]、[2]。目前，快速的工业化和人口增长加剧了废水的产生，给现有的传统水处理基础设施带来了巨大压力[3]。在城市地区，大量废水未经处理，污染了地表水和地下水系统，对整个生态系统造成了威胁[4]。因此，在这种背景下，人们对替代性环保技术的兴趣日益浓厚，这些技术利用光合绿藻进行废水处理[3]。绿藻被认为是全球光合作用的主要贡献者，几乎占光合作用的50%，具有强大的营养物质去除能力，有助于稳定整个生物地球化学循环，从而减少气候变化的影响[4]。然而，尽管植物修复技术在环境上稳定且经济上可行，但仍存在一些限制，可能阻碍其广泛应用[5]。例如，某些藻类（包括蓝绿藻）对污水中营养物质的去除效率较低，生长速度慢，导致处理时间延长，从而降低整个系统的生产力和效率。因此，在这些情况下，有效消除污染物仍然是大规模应用面临的挑战[6]。为了解决这些问题，将光合蓝细菌与先进的纳米材料（称为“氰纳米混合体”）结合使用，成为一种有前景的策略，用于可持续的废水处理，以实现资源回收和有价值代谢物的生产，因为这些纳米材料具有出色的吸附能力。多项研究表明，基于金属的纳米材料（如氧化锌（ZnO）、二氧化钛（TiO?）和二氧化锰（MnO?）在污染物降解方面表现出良好效果，这主要归功于它们较高的催化活性、较大的比表面积和显著的吸附潜力[7]、[8]、[9]。特别是Vasistha等人（2021年）的研究表明，将ZnO纳米颗粒与微藻Chlorosarcinopsis sp.结合使用，显著提高了Okhla污水处理厂的营养物质去除效率。这种纳米-生物结合还提高了藻类的生物量产量和脂质分子的合成，表明纳米材料与藻类平台之间存在协同效应。另一方面，也有研究表明，基于石墨烯的纳米材料（如GO、r-GO、GQD等）在废水修复中表现出色，因为它们具有较大的比表面积、较高的机械强度和可调的表面化学性质，从而增强了污染物的吸附能力[10]、[11]，但石墨烯的生态毒性是一个主要问题，可能对水生生物造成风险，并部分破坏环境平衡。有趣的是，功能化处理显著降低了这些负面影响，同时提高了营养物质（尤其是氮和磷）的去除选择性和有效性[12]。鉴于此，本研究展示了胺功能化石墨烯（AF-G）的潜力，即将胺基（–NH?）引入石墨烯，为蓝细菌提供了不可或缺的大量营养物质——氮，这对细胞增殖、蛋白质合成和叶绿素生产至关重要。这种富含氮的表面不仅加速了营养物质交换，还通过增加石墨烯的亲水性和表面粗糙度，改善了藻细胞的代谢，从而增强了吸附效果。与其他功能化基团（如羧基（–COOH）或羟基（–OH）不同，后者可能会改变表面电荷，但无法提供必要的营养物质，而胺基则专门提供额外的氮补充。因此，将AF-G应用于废水处理是一个更有优势的选择，有利于藻类的持续生长、生物量的增加和污染物的去除。此外，用胺基（–NH?）修饰石墨烯引入了富电子的氮功能，显著增加了表面活性位点的密度[13]、[14]。这些胺基通过与污染物的路易斯碱-酸相互作用、亲核取代和螯合作用进行相互作用，尤其是在废水中的污染物情况下。表面化学性质还受到胺基质子化状态的影响，根据溶液pH值可在中性–NH?和带正电的–NH??之间切换，从而实现pH可调的吸附行为[15]。这对于通过静电吸引和π–π相互作用选择性地结合阴离子污染物（如染料和磷酸盐）至关重要。因此，将碳基纳米材料与绿藻结合使用，为污水的可持续处理铺平了道路，因为它既能去除污染物，又能从藻类生物质中生成多种产品。
尽管由于蓝绿藻含有高量的脂质，因此已对其用于生物柴油生产进行了广泛研究[1]、[16]，但关于其抗氧化能力的研究相对较少。脂质具有强大的抗氧化活性，能有效中和紫外线辐射和环境压力产生的活性氧（ROS）[17]。这些生物活性脂质在抑制脂质过氧化方面起着关键作用，从而保护细胞膜免受氧化损伤[18]。此外，它们还能通过下调促炎细胞因子和介质来发挥显著的抗炎作用，有助于维持细胞稳态和皮肤健康[17]、[18]。然而，由于蓝绿藻在变化的环境条件下的生长和代谢性能不稳定，大规模应用受到限制。pH值、营养物质可用性和光照强度等因素会显著影响它们的生理反应，从而影响其在废水处理和生物燃料生产中的效果。为了解决这些问题，最近的研究结合了人工智能（AI）技术来预测蓝细菌的生长模式并优化培养策略。Purnomo等人（2016年）利用极限学习机器评估了20天内的pH依赖性生长行为[19]。基于这些计算进展，本研究探讨了将胺功能化石墨烯（AF-G）作为纳米结构添加剂应用于废水环境以刺激蓝细菌活性的方法。功能化石墨烯提高了分散性，增强了静电相互作用，可能有助于营养物质吸收和光合作用效率。Supriyanto等人（2018年）的研究利用人工神经网络和决策树模型基于多参数数据集预测了生物量和营养物质去除情况[20]。Levasseur等人（2022年）利用推理AI技术研究了交替光照周期的影响，而He等人（2018年）结合拉曼光谱技术评估了藻类生长趋势对富营养化的作用[21]、[22]。总体而言，这些研究强调了基于AI的分析和功能纳米材料在推进蓝细菌植物修复方面的价值。
许多绿藻因其在废水处理中的高脂质产量而闻名；然而，一些潜在的蓝细菌菌株仍未得到充分研究。Synechocystis sp.是一种强大的原核光合蓝细菌，具有全球二氧化碳（CO2封存、氮（N）和磷（P）去除以及生产多种高价值化合物的潜力，但尚未探索其与生物工程石墨烯纳米结构的结合在污染物去除和脂质生产方面的应用。
基于以上考虑，本研究旨在通过封闭循环的可持续框架，利用集成AI方法评估原始石墨烯（P-G）和胺功能化石墨烯（AF-G）与分离的蓝细菌Synechocystis sp. SS123_AK结合在污水处理中的潜力。本研究的具体目标包括：i) 评估通过添加P-G和AF-G增强遗传鉴定的蓝绿藻的生物量和营养物质去除率；ii) 详细表征PG和AF-G；iii) 评估这种氰纳米混合体在脂质生产方面的潜力，观察其生物柴油和抗氧化潜力；iv) 利用植物修复后的水进行Vigna radiata的灌溉和种子发芽，分析循环生物经济性；v) 研究整个实验策略中AI方法的应用。据我们所知，这是首份报告，展示了使用AF-G补充的Synechocystis sp. SS123_AK进行废水处理、脂质生产和农业再利用的生物-纳米-AI集成方法。
章节摘录
蓝绿藻的分离与鉴定
蓝绿藻是从印度古吉拉特邦瓦多达拉市帕鲁尔大学污水处理厂（STP）收集的污水中分离出来的。分离前，用去离子水彻底冲洗培养物以去除大颗粒和杂质。通过详细的显微镜检查，根据其无菌性质、形态和大小对分离株进行鉴定。首先在BG-11培养基中培养蓝细菌，然后进行系列操作
分离蓝细菌的形态学和遗传学鉴定
根据形态学和遗传学鉴定，分离出的蓝细菌被鉴定为Synechocystis sp. SS123_AK。根据形态测量观察（图1），Synechocystis sp. SS123_AK是一种单细胞、球形至略椭圆形的蓝细菌，直径通常在1至2.5微米之间。这些细胞无鞭毛，通常单独存在或呈松散簇状排列。作为革兰氏阴性生物，Synechocystis具有薄薄的肽聚糖层
结论
本研究强调了AF-G在提高Synechocystis sp. SS123_AK处理污水的性能方面的作用，有助于回收有价值的代谢物（如脂质）。基于AI的回归模型成功预测了不同条件下的光学密度（OD）。值得注意的是，堆叠集成模型的表现最佳，R2值为0.9839，均方误差（MAE）较低，通过交叉验证验证了模型的稳健性
资金声明
安韦莎·德伊（Anwesha Dey）获得了DST SERB TARE（文件编号TAR/2022/000232）的财政支持。索努·甘地（Sonu Gandhi）感谢新德里生物技术部（DBT）提供的财政支持（项目编号BT/PR52345/BSA/33/37/2024（CN19592）。
CRediT作者贡献声明
普林斯·贾因（Prince Jain）：撰写初稿、软件开发、数据管理。朱希·萨克塞纳（Juhi Saxena）：撰写初稿、数据管理、概念设计。安韦莎·德伊（Anwesha Dey）：审稿与编辑、撰写初稿、方法论设计、研究实施、资金申请、概念设计。阿努帕姆·乔蒂（Anupam Jyoti）：审稿与编辑、监督。贾伊维克·帕塔克（Jaivik Pathak）：验证、数据管理。德里希亚·普拉卡尚（Drishya Prakashan）：撰写初稿、资源提供、概念设计。安舒·库马尔（Anshu Kumar）：方法论设计、研究实施。索努·甘地（Sonu Gandhi）：利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者AD和SAK感谢DST SERB TARE（文件编号TAR/2022/000232）提供的财政支持。作者AD、PJ、JS、AK、AJ和UJ还感谢帕鲁尔大学（Parul University, Vadodara）提供的必要研究设施。作者还感谢印度甘地纳加尔理工学院（Indian Institute of Technology Gandhinagar, Palaj 382355, Gujarat）的Soumyadeep Sett博士提供的共聚焦显微镜分析，以及班加罗尔印度科学研究所（IISC Bengaluru）的Saptarshi Basu教授提供的扫描电子显微镜（SEM）分析。
